アグロバクテリウム・リゾゲネスに基づく毛状根形質転換による効率的かつ再現性の高い複合植物の生産法
Summary
ここでは、複合植物を生産するために アグロバクテリウムツメファシエンス によって媒介されるワンステップ形質転換方法の詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
Agrobacterium rhizogenesを介した毛状根の形質転換を用いて、トランスジェニック根と非トランスジェニック茎および芽を有する複合植物を作製することは、根関連の生物学を研究するための強力なツールです。毛状根の形質転換は、広範囲の双子葉植物およびいくつかの単子葉植物種において確立されており、遺伝子型とはほとんど無関係である。複合植物を得るためのA.根茎による胚軸注射の伝統的な方法は、非効率的で、時間がかかり、面倒であり、そしてしばしば柔らかくて小さな胚軸植物の死を引き起こす。A. rhizogenesによって媒介される非常に効率的なワンステップの毛状根形質転換が以前に確立されており、毛状根を生成した後の移植の必要性がなくなりました。この研究では、部分的な胚軸と一次根を取り除き、胚軸切開部位をA.リゾゲネスでコーティングし、次に胚軸を滅菌バーミキュライトに植えました。12日間の栽培後,胚軸切開部が拡大し,新たな毛状根が誘導された.本稿では、A. rhizogenesが媒介するワンステップ形質転換法の詳細なプロトコルを提供し、野生ダイズ、ナスアメリカナム、カボチャの複合植物を生産することによってその有効性を実証します。
Introduction
アグロバクテリウム根粒菌は、リゾビア科のグラム陰性土壌細菌です。 A.根粒菌は、ほとんどすべての双子葉植物、いくつかの単子葉植物、および個々の裸子植物に創傷を介して感染し、感染した植物に毛状の根を作り出す可能性があります。細菌はRi(根誘導)プラスミドを持ち、RiプラスミドのT-DNAはオピン合成遺伝子とロール遺伝子(根座遺伝子)を持っています。RiプラスミドのT-DNAが植物細胞に入り、宿主染色体に組み込まれた後、ロール遺伝子の発現により毛状根の産生が誘導されます1。目的遺伝子を持つ植物二元発現ベクターをA.リゾゲネスに形質転換し、形質転換したA.リゾゲネスを用いて植物に感染させる。 トランスジェニック根は、感染した植物において誘導され得、トランスジェニック根および非トランスジェニック茎および芽を含む複合植物を産生する。一般的に、複合植物は14-20日以内に得ることができます。A. 根茎媒介の毛状根形質転換は、一般に双子葉植物の遺伝子型によって制限されない2.A. rhizogenesに感染した植物が産生する毛状の根は、成長速度が速く、遺伝が安定しており、操作が簡単なという特徴があります。A. rhizogenesによって媒介される毛状根の形質転換は、現在、根関連生物学の研究に広く使用されている。さらに、毛状根の形質転換は、CRISPR/Cas9システム3,4,5およびタンパク質細胞内局在の標的編集効率を検証および最適化するためにも使用できます。したがって、毛状根の形質転換は、植物の遺伝子機能、代謝工学、および根と根圏微生物との相互作用に関する研究において重要なツールです6,7,8。
毛状根の形質転換によって得られたトランスジェニック根を含む複合植物は、双子葉植物、特にマメ科植物で広く生産されています。胚軸にA.リゾゲネスを注入する伝統的な方法は、複合ロータスコルニキュラタス9、大豆10、トマト11、サツマイモ12、および他の多くの植物5,8を生産するために使用されてきました。胚軸注射法は非効率的であり、若いまたは小さな胚軸植物の死を引き起こす可能性があります。そこで,胚根を切り取り,苗の切開部にA. rhizogenesを塗布した後,発根栽培用無菌培地に胚軸を置くことで方法を改良した13。しかしながら、これらのステップは無菌環境で行われ、操作ステップは比較的煩雑である。特に、得られた複合植物は移植する必要があり、それは作業量を増加させる。以前の研究では、キュウリ、ダイズ、ハスジャポニクス、メディカゴトランカチュラ、およびトマト2,14,15,16,17でワンステップA.リゾゲネス媒介(ARM)毛状根形質転換が確立されました。一次根と部分的な胚軸を取り除き、残りの胚軸の切開部位を形質転換A.リゾゲネスでコーティングし、その後、苗を湿った滅菌バーミキュライトに植えました。12日間の栽培後、切開部位に毛状の根ができました。ワンステップARM法は非常に効率的で、毛状の根を作るのに必要な時間が短くて済みます。毛状の根を形成した後の移植も必要ではありません。微生物汚染は移植なしで回避できるため、ワンステップARM法は、マメ科植物と根粒菌の間の共生窒素固定、植物とアーバスキュラー菌根菌の間の共生など、植物と微生物間の相互作用を研究する場合に特に役立ちます。この論文では、野生ダイズ、ナスアメリカナム、およびカボチャで生産された複合植物の例を使用して、詳細なワンステップA.リゾゲネスを介した毛状根の形質転換プロトコルを提供します。このプロトコルにより、研究者はワンステップのARM変換をスムーズに実行できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ワンステップ A.リゾゲネス媒介毛根法は、胚軸注入法よりも単純で効率的な複合植物の生産方法です。ワンステップARM法は、毛状根の形質転換の効率を大幅に向上させ、毛状根を生成する時間を短縮し、毛状根の数を増やし、関連する作業量を減らします。改良された形質転換プロトコルは、マメ科植物と根粒菌の間、および植物とアーバスキュラー菌根菌の間の共生に関する研究に?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、聊城大学研究基金(318012028)と山東省自然科学財団(ZR2020MC034)の支援を受けました。
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
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