Un método eficiente y reproducible para producir plantas compuestas mediante la transformación de raíces peludas basadas en Agrobacterium rhizogenes
Summary
Aquí, proporcionamos el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir plantas compuestas.
Abstract
La producción de plantas compuestas con raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos utilizando la transformación de raíces pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes es una herramienta poderosa para estudiar la biología relacionada con las raíces. La transformación de la raíz pilosa se establece en una amplia gama de dicotiledóneas y en varias especies de monocotiledóneas y es casi independiente del genotipo. El método tradicional de inyección de hipocótilo con A. rhizogenes para obtener plantas compuestas es ineficiente, requiere mucho tiempo, es laborioso y con frecuencia causa la muerte de plantas de hipocótilo tiernas y diminutas. Previamente se estableció una transformación de raíz pilosa altamente eficiente de un solo paso mediada por A. rhizogenes , lo que elimina la necesidad de trasplante después de producir raíces pilosas. En este estudio, se extirpó un hipocótilo parcial y una raíz primaria, se recubrió el sitio de incisión del hipocótilo con A. rhizogenes y luego se plantaron hipocótilos en vermiculita estéril. Después de 12 días de cultivo, la incisión del hipocótilo se expandió y se indujeron nuevas raíces pilosas. Este artículo proporciona el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por A. rhizogenes, cuya eficacia se ha demostrado mediante la producción de plantas compuestas de soja silvestre, Solanum americanum y calabaza.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria gramnegativa del suelo de la familia Rhizobiaceae. A. rhizogenes puede infectar casi todas las dicotiledóneas, algunas monocotiledóneas y gimnospermas individuales a través de heridas, produciendo raíces pilosas en las plantas infectadas. La bacteria es portadora del plásmido Ri (inductor de raíces), y el ADN-T del plásmido Ri es portador del gen de síntesis de opina y de los genes de rol (genes del locus de la raíz). Después de que el ADN-T del plásmido Ri entra en una célula vegetal y se integra en un cromosoma huésped, la expresión de los genes del rol induce la producciónde raíces pilosas. Un vector de expresión binaria de una planta portador de un gen diana se transforma en A. rhizogenes, y el A. rhizogenes transformado se utiliza para infectar una planta. Las raíces transgénicas pueden ser inducidas en plantas infectadas, produciendo plantas compuestas que contienen raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos. Generalmente, una planta compuesta se puede obtener en un plazo de 14 a 20 días. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes generalmente no está limitada por el genotipo en las plantas dicotiledóneas2. Las raíces peludas producidas por plantas infectadas con A. rizogenes se caracterizan por una tasa de crecimiento rápida, una herencia estable y una fácil operación. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rhizogenes se utiliza actualmente ampliamente para estudiar la biología relacionada con la raíz. Además, la transformación de las raíces pilosas también se puede utilizar para validar y optimizar la eficiencia de edición de objetivos del sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 y la localización subcelular de proteínas. Por lo tanto, la transformación de la raíz pilosa es una herramienta importante en la investigación sobre la función de los genes de las plantas, la ingeniería metabólica y las interacciones entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera 6,7,8.
Las plantas compuestas que contienen raíces transgénicas obtenidas a través de la transformación de raíces pilosas se han producido ampliamente en plantas dicotiledóneas, especialmente en leguminosas. El método tradicional de inyectar el hipocótilo con A. rhizogenes se ha utilizado para producir Lotus corniculatus9, soja 10, tomate11, batata12 y muchas otras plantas 5,8. El método de inyección de hipocótilo es ineficiente y es probable que cause la muerte de plantas jóvenes o diminutas de hipocótilo. Por lo tanto, el método se mejoró cortando las raíces embrionarias, cubriendo la incisión de la plántula con A. rhizogenes y luego colocando el hipocótilo en un medio de cultivo estéril para el cultivo de enraizamiento13. Sin embargo, esos pasos se realizan en un entorno estéril y los pasos de la operación son relativamente engorrosos. En particular, las plantas compuestas resultantes deben trasplantarse, lo que aumenta la cantidad de trabajo. En trabajos anteriores, se estableció la transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes (ARM) en un solo paso en pepino, soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula y tomate 2,14,15,16,17. Se eliminaron la raíz primaria y el hipocótilo parcial, el sitio de incisión del hipocótilo restante se recubrió con A. rizogenes transformado y la plántula se plantó en vermiculita estéril húmeda. Después de 12 días de cultivo, se produjeron raíces pilosas en el sitio de la incisión. El método ARM de un solo paso es altamente eficiente y requiere menos tiempo para producir raíces pilosas. Tampoco es necesario trasplantar después de formar raíces peludas. Debido a que la contaminación microbiana se puede evitar sin trasplante, el método ARM de un solo paso puede ser particularmente útil cuando se estudian las interacciones entre plantas y microorganismos, como la fijación simbiótica de nitrógeno entre plantas leguminosas y rizobios, y simbiosis entre plantas y hongos micorrícicos arbusculares. En este artículo, se proporciona un protocolo detallado de transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes de un solo paso con ejemplos de plantas compuestas producidas en soja silvestre, Solanum americanum y calabaza. Con el protocolo, los investigadores pueden realizar sin problemas la transformación de ARM en un solo paso.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de raíz pilosa mediada por A. rizogenes en un solo paso es un método más simple y eficiente para producir plantas compuestas que el método de inyección de hipocótilo. El método ARM de un solo paso mejora significativamente la eficiencia de la transformación de las raíces pilosas, acorta el tiempo para producir raíces pilosas, aumenta el número de raíces pilosas y reduce la cantidad de trabajo involucrado. El protocolo de transformación mejorado es óptimo para estudios de simbiosis entre …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Fondo de Investigación de la Universidad de Liaocheng (318012028) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
