Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-gebaseerde snelle diagnose van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie
Summary
Het protocol presenteert een niet-invasieve methode voor de snelle diagnose van Helicobacter pylori-maaginfecties door middel van de stringtest en bepaalt de antibioticaresistentie tegen claritromycine en levofloxacine met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR).
Abstract
Helicobacter pylori is een belangrijke menselijke ziekteverwekker die ongeveer de helft van de wereldbevolking infecteert en een ernstige bedreiging voor de gezondheid wordt vanwege de toenemende antibioticaresistentie. Het is de veroorzaker van chronische actieve gastritis, maagzweren en maagkanker en is geclassificeerd als een groep I carcinogeen door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek. Daarom zijn de snelle en nauwkeurige diagnose van H. pylori en de bepaling van de antibioticaresistentie belangrijk voor de efficiënte uitroeiing van deze bacteriële ziekteverwekker. Momenteel omvatten de diagnosemethoden van H. pylori voornamelijk de ureumademtest (UBT), de antigeentest, de serumantilichaamtest, gastroscopie, de snelle ureasetest (RUT) en bacteriecultuur. Onder hen zijn de eerste drie detectiemethoden niet-invasief, wat betekent dat het eenvoudige tests zijn om uit te voeren. Bacteriën kunnen echter niet via deze technieken worden opgehaald; Het testen van resistentie tegen geneesmiddelen kan dus niet worden uitgevoerd. De laatste drie zijn invasieve onderzoeken, maar ze zijn duur, vereisen hoge vaardigheden en hebben het potentieel om schade aan patiënten te veroorzaken. Daarom is een niet-invasieve, snelle en gelijktijdige methode voor H. pylori-detectie en medicijnresistentietests erg belangrijk voor het efficiënt uitroeien van H. pylori in de klinische praktijk. Dit protocol heeft tot doel een specifieke procedure te presenteren met de stringtest in combinatie met kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) voor de snelle detectie van H. pylori-infectie en antibioticaresistentie. In tegenstelling tot bacterieculturen zorgt deze methode voor een eenvoudige, snelle, niet-invasieve diagnose van de H. pylori-infectiestatus en medicijnresistentie. Specifiek gebruikten we qPCR om rea te detecteren voor H. pylori-infectie en mutaties in de 23S-rRNA- en gyrA-genen , die coderen voor resistentie tegen respectievelijk claritromycine en levofloxacine. In vergelijking met routinematig gebruikte kweektechnieken biedt dit protocol een niet-invasieve, goedkope en tijdbesparende techniek om H. pylori-infectie te detecteren en de antibioticaresistentie te bepalen met behulp van qPCR.
Introduction
H. pylori is een spiraalvormige, zeer beweeglijke, gramnegatieve bacterie die voornamelijk in het pylorusgebied van de maagleeft 1. Het is een veel voorkomende ziekteverwekker die bijna 50% van de wereldbevolking infecteert2. De meeste mensen met H. pylori-infectie hebben geen klinische manifestaties en de meeste ontwikkelen verschillende ziekten na enkele jaren van infectie, waaronder chronische gastritis, maagzweren, maagzweren en maagkanker3. In verschillende studies op basis van verschillende populaties is de werkzaamheid van het elimineren van H. pylori voor het voorkomen van maagkanker en precancereuze laesies aangetoond 4,5. Daarom heeft het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) H. pylori-uitroeiing geadviseerd als een preventieve maatregel6.
Het gebruik van niet-invasieve methoden om H. pylori-infectie te identificeren is een belangrijk onderdeel van de behandeling voor de meeste personen met asymptomatische dyspepsie. De ureumademtest (UBT), H. pylori fecale antigeentest (SAT) en serologische testen zijn populaire niet-invasieve technieken. Onder deze is de UBT de minst indringende en meest nauwkeurige procedure die beschikbaar is. UBT gebruikt urease, overvloedig aanwezig in H. pylori, om isotopisch gelabeld ureum te hydrolyseren tot ammoniak en koolstofdioxide (13C of 14C). De immunochromatografische test (ICA)7 is daarentegen handig, eenvoudig en niet-invasief voor bemonstering. De nauwkeurigheid van de test wordt echter beïnvloed door verschillende factoren, zoals de kwaliteit van het ontlastingsmonster, de temperatuur en het interval tussen het verzamelen van monsters en het testen. Een andere test op basis van de immuunrespons is de serum H. pylori-antilichaamtest , die antilichamen in het serum van een patiënt detecteert. Deze test is echter niet geschikt voor analyse na de behandeling, omdat de antilichamen lang blijven nadat de bacteriën zijn opgeruimd8. Een ander groot nadeel is dat deze methoden alleen H. pylori-infectie diagnosticeren en geen medicijnresistentietests toestaan om op gevoeligheid gebaseerde behandeling te begeleiden.
Voor invasieve testmethoden moet maagbiopsieweefsel worden genomen door endoscopie en vervolgens worden onderworpen aan histologie, de urease-sneltest en bacteriecultuur. Deze testmethoden zijn ook zeer beperkt vanwege verschillende factoren. Momenteel zijn deze technieken beperkt tot oudere patiënten, patiënten met een hoog risico op precancereuze of kwaadaardige ziekte en patiënten die hebben gefaald in de eerstelijnstherapie voor gastro-oesofageale refluxziekte of H. pylori-infectie 9. Ten tweede, vanwege de unieke groeikenmerken van H. pylori, bereikt het slagingspercentage van bacteriecultuur slechts 50% 10. Moleculaire detectiemethoden bieden dus nieuwe hoop om de hoge eisen van invasieve detectiemethoden te overwinnen en op gevoeligheid gebaseerde behandeling te begeleiden. Onder moleculaire detectiemethoden is kwantitatieve PCR de afgelopen jaren enorm geëvolueerd. qPCR vereist, in tegenstelling tot traditionele PCR, geen gel-elektroforese en kwantificeert DNA / RNA in monsters nauwkeurig door primers en sondes toe te voegen in de gloeifase. qPCR-kits voor de detectie van H. pylori-infectie en medicijnresistentie zijn nu in de handel verkrijgbaar. Toch heeft elke methode zijn beperkingen; Daarom moeten de klinische diagnose en behandeling van een patiënt worden overwogen in combinatie met hun symptomen, tekenen, geschiedenis, andere laboratoriumtests en respons op de behandeling.
Momenteel is de primaire methode voor de behandeling van H.pylori-infecties het nemen van antibiotica, maar de laatste tijd wordt het steeds moeilijker om deze infecties te behandelen vanwege de toename van antibioticaresistentie. Vervolgens is wereldwijd een significante afname van de werkzaamheid van de behandeling met H. pylori waargenomen, waardoor de uitroeiing van H. pylori een belangrijk probleem voor de volksgezondheid isgeworden 11.
Claritromycine en levofloxacine zijn de twee breedspectrumantibiotica die worden gebruikt om infecties veroorzaakt door H.pylori te behandelen, maar verschillende studies hebben wijdverspreide resistentie tegen deze twee geneesmiddelen in H.pylori-isolaten gemeld. A2143G, A2142G en A2142C zijn drie van de talrijke puntmutaties in het 2,9 kb 23S rRNA-gen die resulteren in claritromycineresistentie door te voorkomen dat het macrolide bindt. Tegelijkertijd bevinden de mutatieloci van het levofloxacineresistentiegen zich voornamelijk in de zes mutatieplaatsen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) van het gyrA-gen 12. De ontdekking van deze resistentiemechanismen op basis van genetische mutaties heeft geleid tot een geleidelijke verschuiving in de detectie van H. pylori door middel van culturele studies naar moleculair testen.
Over het algemeen is er een dringende klinische behoefte aan een niet-invasieve, effectieve en gelijktijdige diagnostische methode voor de detectie van H. pylori-infecties en medicijnresistentie. We hebben een gecombineerde stringtest en qPCR-methode aangenomen om de moeilijkheden van bemonstering te overwinnen en het doel van de gelijktijdige detectie van H. pylori-infectie en medicijnresistentie te bereiken met behulp van verschillende primer-sondes.
Protocol
Representative Results
Discussion
H. pylori-detectie kan worden uitgevoerd met behulp van zowel invasieve als niet-invasieve methoden13. Veelgebruikte invasieve technieken zoals histopathologie, de snelle ureasetest, polymerasekettingreactie (PCR) en bacteriële kweek vereisen endoscopie en biopsie. Serologische tests, ureumademtests en enzymgebonden immunosorbenttests (ELISA) worden aanbevolen onder de niet-invasieve procedures14. Hoewel niet-invasieve methoden gemakkelijk uit te voeren, economisc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Sanming Project of Medicine in Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) en de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant No. 2022A1515220023). Research Foundation for Advanced Talents van Guandong Provincial People’s Hospital (Nr. KJ012021097) en de National Natural Science Foundation of China (81871734, 82072380, 82272423). De financiers hadden geen rol in het studieontwerp, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
