Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz
Summary
Das Protokoll stellt eine nicht-invasive Methode zur schnellen Diagnose von Helicobacter pylori-Mageninfektionen durch den String-Test vor und bestimmt die Antibiotikaresistenz gegen Clarithromycin und Levofloxacin mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR).
Abstract
Helicobacter pylori ist ein bedeutender menschlicher Krankheitserreger, der etwa die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert und aufgrund seiner zunehmenden Antibiotikaresistenz zu einer ernsthaften Gesundheitsgefahr wird. Es ist der Erreger von chronisch aktiver Gastritis, Magengeschwüren und Magenkrebs und wurde von der Internationalen Agentur für Krebsforschung als Karzinogen der Gruppe I eingestuft. Daher sind die schnelle und genaue Diagnose von H. pylori und die Bestimmung seiner Antibiotikaresistenz wichtig für die effiziente Ausrottung dieses bakteriellen Erregers. Zu den Diagnosemethoden von H. pylori gehören derzeit vor allem der Harnstoff-Atemtest (UBT), der Antigentest, der Serum-Antikörpertest, die Gastroskopie, der Urease-Schnelltest (RUT) und die Bakterienkultur. Unter ihnen sind die ersten drei Nachweismethoden nicht-invasiv, was bedeutet, dass sie einfach durchzuführen sind. Bakterien können mit diesen Techniken jedoch nicht zurückgewonnen werden. Daher können keine Arzneimittelresistenztests durchgeführt werden. Bei den letzten drei handelt es sich um invasive Untersuchungen, die jedoch kostspielig sind, hohe Fähigkeiten erfordern und das Potenzial haben, den Patienten Schaden zuzufügen. Daher ist eine nicht-invasive, schnelle und simultane Methode zum Nachweis von H. pylori und zur Prüfung von Arzneimittelresistenzen sehr wichtig, um H. pylori in der klinischen Praxis effizient zu eraminieren . Ziel dieses Protokolls ist es, ein spezifisches Verfahren vorzustellen, das den String-Test in Kombination mit der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zum schnellen Nachweis von H. pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen umfasst. Im Gegensatz zu Bakterienkulturen ermöglicht diese Methode eine einfache, schnelle und nicht-invasive Diagnose des Infektionsstatus und der Arzneimittelresistenz von H. pylori. Konkret haben wir qPCR verwendet, um Rea für eine H. pylori-Infektion und Mutationen in den Genen 23S rRNA und gyrA nachzuweisen, die für Resistenzen gegen Clarithromycin bzw. Levofloxacin kodieren. Im Vergleich zu routinemäßig verwendeten Kultivierungstechniken bietet dieses Protokoll eine nicht-invasive, kostengünstige und zeitsparende Technik zum Nachweis einer H. pylori-Infektion und zur Bestimmung der Antibiotikaresistenz mittels qPCR.
Introduction
H. pylori ist ein spiralförmiges, hochbewegliches, gramnegatives Bakterium, das hauptsächlich in der Pylorusregion des Magenslebt 1. Es handelt sich um einen weit verbreiteten Krankheitserreger, der fast 50 % der Weltbevölkerung infiziert2. Die meisten Menschen mit einer H. pylori-Infektion haben keine klinischen Manifestationen, und die meisten entwickeln nach mehreren Jahren der Infektion verschiedene Krankheiten, darunter chronische Gastritis, Magengeschwüre, Magengeschwüre und Magenkrebs3. In mehreren Studien, die auf verschiedenen Populationen basierten, wurde die Wirksamkeit der Eliminierung von H. pylori zur Vorbeugung von Magenkrebs und Krebsvorstufen nachgewiesen 4,5. Daher hat die Internationale Agentur für Krebsforschung der Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Ausrottung von H. pylori als vorbeugende Maßnahme empfohlen6.
Der Einsatz nicht-invasiver Methoden zur Identifizierung einer H. pylori-Infektion ist für die meisten Personen mit asymptomatischer Dyspepsie eine Schlüsselkomponente der Behandlung. Der Harnstoff-Atemtest (UBT), der H. pylori-Stuhlantigentest (SAT) und serologische Tests sind beliebte nichtinvasive Techniken. Unter diesen ist die UBT das am wenigsten einschneidende und genaueste Verfahren, das es gibt. UBT verwendet Urease, die in H. pylori reichlich vorhanden ist, um isotopenmarkierten Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid (13C oder 14C) zu hydrolysieren. Im Gegensatz dazu ist der immunchromatographische Assay (ICA)7 für die Probenahme bequem, einfach und nicht-invasiv. Die Genauigkeit des Tests wird jedoch von mehreren Faktoren beeinflusst, wie z. B. der Qualität der Stuhlprobe, der Temperatur und dem Intervall zwischen der Probenentnahme und dem Test. Ein weiterer Test, der auf der Immunantwort basiert, ist der H. pylori-Antikörpertest im Serum, der Antikörper im Serum eines Patienten nachweist. Dieser Test eignet sich jedoch nicht für die Analyse nach der Behandlung, da die Antikörper noch lange nach der Beseitigung der Bakterien vorhanden sind8. Ein weiterer großer Nachteil ist, dass diese Methoden nur eine H. pylori-Infektion diagnostizieren und keine Arzneimittelresistenztests zur Steuerung einer sensitivitätsbasierten Behandlung ermöglichen.
Für invasive Testmethoden muss das Magenbiopsiegewebe endoskopisch entnommen und anschließend histologisch, mit dem Urease-Schnelltest und der Bakterienkultur behandelt werden. Auch diese Testmethoden sind aufgrund mehrerer Faktoren sehr eingeschränkt. Derzeit sind diese Techniken auf ältere Patienten, Patienten mit hohem Risiko für präkanzeröse oder bösartige Erkrankungen und Patienten beschränkt, bei denen die Erstlinientherapie der gastroösophagealen Refluxkrankheit oder einer H. pylori-Infektion versagt hat9. Zweitens erreicht die Erfolgsrate der Bakterienkultur aufgrund der einzigartigen Wachstumseigenschaften von H. pylori nur 50 %10. Molekulare Nachweismethoden bieten daher neue Hoffnung, um die hohen Anforderungen invasiver Nachweismethoden zu überwinden und eine sensitivitätsbasierte Behandlung zu steuern. Unter den molekularen Nachweismethoden hat sich die quantitative PCR in den letzten Jahren enorm weiterentwickelt. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR erfordert die qPCR keine Gelelektrophorese und quantifiziert DNA/RNA in Proben genau, indem Primer und Sonden in der Annealing-Phase hinzugefügt werden. qPCR-Kits zum Nachweis von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen sind jetzt im Handel erhältlich. Dennoch hat jede Methode ihre Grenzen; Daher sollten die klinische Diagnose und Behandlung eines Patienten in Verbindung mit seinen Symptomen, Anzeichen, seiner Anamnese, anderen Labortests und dem Ansprechen auf die Behandlung betrachtet werden.
Derzeit ist die primäre Methode zur Behandlung von H. pylori-Infektionen die Einnahme von Antibiotika, aber in letzter Zeit wird es aufgrund der Zunahme von Antibiotikaresistenzen immer schwieriger, diese Infektionen zu behandeln. In der Folge wurde weltweit ein deutlicher Rückgang der Wirksamkeit der Behandlung von H. pylori beobachtet, was die Ausrottung von H. pylori zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit macht11.
Clarithromycin und Levofloxacin sind die beiden Breitbandantibiotika, die zur Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, die durch H. pylori verursacht werden, aber mehrere Studien haben eine weit verbreitete Resistenz gegen diese beiden Medikamente in H. pylori-Isolaten berichtet. A2143G, A2142G und A2142C sind drei der zahlreichen Punktmutationen, die im 2,9 kb 23S rRNA-Gen gefunden wurden und zu einer Clarithromycin-Resistenz führen, indem sie die Bindung des Makrolids verhindern. Gleichzeitig befinden sich die Mutationsorte des Levofloxacin-Resistenzgens hauptsächlich in den sechs Mutationsstellen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) des gyrA-Gens 12. Die Entdeckung dieser Resistenzmechanismen, die auf genetischen Mutationen beruhen, hat zu einer allmählichen Verlagerung des Nachweises von H. pylori durch kulturbasierte Studien hin zu molekularen Tests geführt.
Insgesamt besteht ein dringender klinischer Bedarf an einer nicht-invasiven, effektiven und simultanen diagnostischen Methode zum Nachweis von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen. Wir haben eine kombinierte String-Test- und qPCR-Methode eingesetzt, um die Schwierigkeiten bei der Probenahme zu überwinden und das Ziel des gleichzeitigen Nachweises von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen mit verschiedenen Primersonden zu erreichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Nachweis von H. pylori kann sowohl mit invasiven als auch mit nicht-invasiven Methoden durchgeführt werden13. Häufig verwendete invasive Techniken wie Histopathologie, Urease-Schnelltest, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und bakterielle Kultivierung erfordern Endoskopie und Biopsie. Zu den nicht-invasiven Verfahren gehören serologische Tests, Harnstoff-Atemtests und Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA)14. Während nichtinvasive Methoden einfach durchzuf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Sanming Project of Medicine in Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) und der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Fördernummer 2022A1515220023). Forschungsstiftung für fortgeschrittene Talente des Volkskrankenhauses der Provinz Guandong (Nr. KJ012021097) und der National Natural Science Foundation of China (81871734, 82072380, 82272423). Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
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