Målrettet metabolomikk på sjeldne primære celler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for nøyaktig og pålitelig måling av metabolitter i sjeldne celletyper. Tekniske forbedringer, inkludert en modifisert hylstervæske for cellesortering og generering av relevante blanke prøver, muliggjør en omfattende kvantifisering av metabolitter med en inngang på bare 5000 celler per prøve.

Abstract

Cellulær funksjon avhenger kritisk av metabolisme, og funksjonen til de underliggende metabolske nettverkene kan studeres ved å måle mellomprodukter fra små molekyler. Imidlertid har oppnåelse av nøyaktige og pålitelige målinger av cellulær metabolisme, spesielt i sjeldne celletyper som hematopoietiske stamceller, tradisjonelt krevd samling av celler fra flere dyr. En protokoll gjør det nå mulig for forskere å måle metabolitter i sjeldne celletyper ved å bruke bare en mus per prøve, mens de genererer flere replikater for mer rikelig celletyper. Dette reduserer antall dyr som kreves for et gitt prosjekt. Protokollen som presenteres her innebærer flere viktige forskjeller i forhold til tradisjonelle metabolomics-protokoller, for eksempel bruk av 5 g / L NaCl som skjede væske, sortering direkte i acetonitril og bruk av målrettet kvantifisering med streng bruk av interne standarder, noe som muliggjør mer nøyaktige og omfattende målinger av cellulær metabolisme. Til tross for tiden som kreves for isolering av enkeltceller, fluorescerende farging og sortering, kan protokollen i stor grad bevare forskjeller mellom celletyper og medikamentelle behandlinger.

Introduction

Metabolisme er en viktig biologisk prosess som forekommer i alle levende celler. Metabolske prosesser involverer et stort nettverk av biokjemiske reaksjoner som er tett regulert og sammenkoblet, slik at celler kan produsere energi og syntetisere essensielle biomolekyler¹. For å forstå funksjonen til metabolske nettverk, måler forskere nivåene av mellomprodukter av små molekyler i celler. Disse mellomproduktene tjener som viktige indikatorer på metabolsk aktivitet og kan avsløre kritisk innsikt i cellulær funksjon.

Massespektrometri (MS) er det mest populære valget for spesifikk påvisning av metabolitter i komplekse prøver ^1,2. Kjernemagnetisk resonans (NMR) har fordeler i absolutt kvantifisering av forbindelser og strukturoppklaring, men MS kan ofte løse flere komponenter i komplekse blandinger som biofluider eller celleekstrakter. Oftere enn ikke kombineres MS med tidligere separasjon av forbindelsen ved kapillær elektroforese (CE), gasskromatografi (GC) eller væskekromatografi (LC)³. Valget av separasjonsplattform er for det meste drevet av utvalget av målmetabolitter og typen prøve, og i en reell setting av tilgjengeligheten av maskiner og ekspertise. Alle tre separasjonsplattformene har et bredt og overlappende utvalg av egnede metabolitter, men forskjellige begrensninger. Kort fortalt kan CE bare skille ladede molekyler og krever mye kompetanse for å gjennomføre robust analyse av et stort antall prøver⁴. GC er begrenset til molekyler som er små og apolære nok til å fordampe før de brytes ned³. Tatt i betraktning alle kommersielt tilgjengelige LC-kolonner, kan alle to metabolitter separeres ved hjelp av denne teknologien⁵. Imidlertid viser mange LC-metoder mindre oppløsningsevne enn CE- eller GC-metoder av tilsvarende lengde.

Den typiske mengden utgangsmateriale for metabolomikkmålinger er vanligvis i området 5 x 10⁵ til 5 x 10⁷ celler per prøve, 5-50 mg vått vev eller 5-50 μL kroppsvæske⁶. Det kan imidlertid være utfordrende å få tak i slike mengder utgangsmateriale når man arbeider med primærceller av sjeldne celletyper, som for eksempel hematopoietiske stamceller (HSC) eller sirkulerende tumorceller. Disse cellene er ofte til stede i svært lave antall og kan ikke dyrkes uten at det går på bekostning av kritiske cellulære egenskaper.

HSC og multipotente stamceller (MPP) er de minst differensierte cellene i det hematopoietiske systemet og produserer kontinuerlig nye blodceller gjennom en organismes liv. Reguleringen av hematopoiesis er av klinisk relevans i forhold som leukemi og anemi. Til tross for deres betydning er HSC og MPP blant de sjeldneste cellene i det hematopoietiske systemet. Fra en enkelt mus kan vanligvis ca. 5000 HSC-er isoleres ^7,8,9. Siden tradisjonelle metabolomics-metoder krever mer inngangsmateriale, var det ofte nødvendig å samle celler fra flere mus for å analysere sjeldne celletyper^10,11.

Her hadde vi som mål å utvikle en protokoll som muliggjør måling av metabolitter i så lite som 5000 celler per prøve for å muliggjøre generering av metabolomics-data fra HSC-ene til en enkelt mus¹². Samtidig tillater denne metoden å generere flere replikater fra en enkelt mus for mer tallrike celletyper som lymfocytter. Denne tilnærmingen reduserer antall dyr som kreves for et gitt prosjekt, og bidrar dermed til “3R” (reduksjon, erstatning, forfining) av dyreforsøk.

Metabolitter i celler kan ha svært høye omsetningshastigheter, ofte i størrelsesorden^{sekunder 13}. Imidlertid kan forberedelse av prøver for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ta timer, og FACS-sortering i seg selv kan ta minutter til timer, noe som fører til potensielle endringer i metabolomet på grunn av ikke-fysiologiske forhold. Noen av reagensene som brukes i denne protokollen (slik som ammoniumklorid-kalium [ACK] lysisbuffer) kan ha lignende effekter. Disse forholdene kan forårsake cellulær stress og påvirke nivåene og forholdene mellom metabolitter i celler, noe som fører til unøyaktige eller partiske målinger av cellulær metabolisme 14,15,16. De metabolske endringene på grunn av prøvepreparering blir noen ganger referert til som sorteringsartefakter. Lange fordøyelsesprotokoller og sterke reagenser som kan være nødvendige for å produsere enkeltcellesuspensjoner fra hardt eller tøft vev, kan forverre dette problemet. Hvilke endringer som kan oppstå, avhenger sannsynligvis av celletype og behandlingstilstand. Den nøyaktige naturen til endringene forblir ukjent, da den metabolske tilstanden til de uforstyrrede cellene i levende vev ikke kan måles.

Protokollen som presenteres her innebærer flere viktige forskjeller sammenlignet med tradisjonelle metoder, nemlig bruk av 5 g / L NaCl som hylstervæske, sortering direkte i ekstraksjonsbuffer, injisering av store prøvevolumer på hydrofil interaksjon væskekromatografi-massespektrometri (HILIC-MS), og bruk av målrettet kvantifisering, streng bruk av interne standarder og bakgrunnskontroller (figur 1). Denne protokollen har potensial til å bevare forskjeller mellom celletyper og mellom medikamentell behandling og kjøretøykontroll i stor grad¹². Selv for dyrkede celler sammenligner den seg gunstig med alternative tilnærminger, for eksempel den mer etablerte sentrifugeringen og manuell fjerning av supernatant. Siden sortering av artefakter fortsatt kan forekomme, må data tolkes med forsiktighet. Til tross for denne begrensningen representerer protokollen en betydelig forbedring innen metabolsk profilering, noe som muliggjør mer nøyaktige og omfattende målinger av cellulær metabolisme i sjeldne primærceller¹².

Evnen til å robust måle brede metabolske profiler i sjeldne primærceller åpner døren for nye eksperimenter i biomedisinsk forskning som involverer disse cellene. For eksempel har metabolsk mediert regulering i HSC vist seg å påvirke dvalens selvfornyelseskapasitet, med implikasjoner for anemi og leukemi^11,17. I pasientavledede sirkulerende tumorceller er forskjeller i uttrykket av metabolske gener mellom tumor og tilstøtende celler vist^18,19. Denne protokollen tillater nå forskere å studere disse forskjellene systematisk på et metabolsk nivå, som generelt anses som nærmere den cellulære fenotypen enn genuttrykk.

Protocol

Avl og oppdrett av alle mus som ble brukt til denne protokollen ble utført i et konvensjonelt dyreanlegg ved Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics (MPI-IE) i henhold til forskriftene fra de lokale myndighetene (Regierungspräsidium Freiburg). Mus ble avlivet med CO2 og cervical dislokasjon av FELASA B-trent personell etter retningslinjer og forskrifter godkjent av dyrevelferdskomiteen i MPI-IE og de lokale myndighetene. Ingen dyreforsøk ble utført, og mus var uten helsebelastninger. <p …

Representative Results

FACS-sortering gjør det mulig å isolere rene populasjoner av forskjellige celletyper fra samme cellesuspensjon (figur 2 og figur 3). Spesifisiteten til denne metoden er avhengig av farging av de forskjellige celletypene med spesifikke overflatemarkører (for eksempel B-celler og T-celler fra milten) eller spesifikke kombinasjoner av overflatemarkører (for eksempel HSC og MPP). Farging av intracellulære markører krever vanligvis permeabilisering av cellememb…

Discussion

De mest kritiske trinnene for vellykket implementering av målrettet metabolomikk ved bruk av denne protokollen er 1) en robust farge- og gatingstrategi som vil gi rene cellepopulasjoner 2) presis håndtering av væskevolumer, 3) reproduserbar timing av alle eksperimentelle trinn, spesielt alle trinn før metabolittekstraksjon. Ideelt sett bør alle prøver som tilhører ett eksperiment behandles og måles i en batch for å minimere batcheffekter²². For større eksperimenter foreslår vi å samle …

Materials

13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A