Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler
Summary
Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.
Abstract
Hücresel fonksiyon kritik olarak metabolizmaya bağlıdır ve altta yatan metabolik ağların fonksiyonu, küçük moleküllü ara ürünler ölçülerek incelenebilir. Bununla birlikte, özellikle hematopoietik kök hücreler gibi nadir hücre tiplerinde hücresel metabolizmanın doğru ve güvenilir ölçümlerinin elde edilmesi, geleneksel olarak birden fazla hayvandan alınan hücrelerin toplanmasını gerektirmiştir. Bir protokol artık araştırmacıların, daha bol hücre tipleri için birden fazla kopya üretirken, örnek başına yalnızca bir fare kullanarak nadir hücre tiplerindeki metabolitleri ölçmelerini sağlıyor. Bu, belirli bir proje için gerekli olan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan protokol, bir kılıf sıvısı olarak 5 g / L NaCl kullanmak, doğrudan asetonitril’e ayırmak ve iç standartların titiz kullanımıyla hedeflenen miktar tayinini kullanmak gibi geleneksel metabolomik protokollere göre birkaç önemli farklılık içerir ve hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin verir. Tek hücrelerin izolasyonu, floresan boyama ve sıralama için gereken süreye rağmen, protokol hücre tipleri ve ilaç tedavileri arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruyabilir.
Introduction
Metabolizma, tüm canlı hücrelerde meydana gelen önemli bir biyolojik süreçtir. Metabolik süreçler, hücrelerin enerji üretmesine ve temel biyomolekülleri sentezlemesine izin veren, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve birbirine bağlı geniş bir biyokimyasal reaksiyon ağını içerir1. Metabolik ağların işlevini anlamak için araştırmacılar, hücrelerdeki küçük moleküllü ara ürünlerin seviyelerini ölçerler. Bu ara ürünler, metabolik aktivitenin önemli göstergeleri olarak hizmet eder ve hücresel fonksiyona ilişkin kritik bilgileri ortaya çıkarabilir.
Kütle spektrometresi (MS), karmaşık numunelerde metabolitlerin spesifik tespiti için en popüler seçimdir 1,2. Nükleer manyetik rezonans (NMR), bileşiklerin mutlak miktar tayininde ve yapı aydınlatmasında avantajlara sahiptir, ancak MS genellikle biyoakışkanlar veya hücre ekstraktları gibi karmaşık karışımlarda daha fazla bileşeni çözebilir. Çoğu zaman MS, bileşiğin kapiler elektroforez (CE), gaz kromatografisi (GC) veya sıvı kromatografisi (LC) ile önceden ayrılması ile birleştirilir3. Separasyon platformunun seçimi çoğunlukla hedef metabolitlerin aralığı ve numunenin türü ve gerçek dünya ortamında makinelerin ve uzmanlığın mevcudiyeti tarafından yönlendirilir. Her üç ayırma platformunun da geniş ve örtüşen bir uygun metabolit aralığı vardır, ancak farklı sınırlamalar vardır. Kısaca CE, yalnızca yüklü molekülleri ayırabilir ve çok sayıda numunenin sağlam analizini uygulamak için çok fazla uzmanlık gerektirir4. GC, ayrışmadan önce buharlaşacak kadar küçük ve apolar moleküllerle sınırlıdır3. Piyasada bulunan tüm LC kolonları göz önüne alındığında, herhangi iki metabolit bu teknoloji ile ayrılabilir5. Bununla birlikte, birçok LC yöntemi, benzer uzunluktaki CE veya GC yöntemlerinden daha az çözme gücü sergiler.
Metabolomik ölçümler için tipik başlangıç materyali miktarı genellikle numune başına 5 x 105 ila 5 x 107 hücre, 5-50 mg ıslak doku veya 5-50 μL vücut sıvısı6 aralığındadır. Bununla birlikte, örneğin hematopoietik kök hücreler (HSC’ler) veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi nadir hücre tiplerinin birincil hücreleriyle çalışırken bu miktarlarda başlangıç materyali elde etmek zor olabilir. Bu hücreler genellikle çok düşük sayılarda bulunur ve kritik hücresel özelliklerden ödün vermeden yetiştirilemez.
HSC’ler ve multipotent progenitör hücreler (MPP’ler), hematopoetik sistemin en az farklılaşmış hücreleridir ve bir organizmanın yaşamı boyunca sürekli olarak yeni kan hücreleri üretir. Hematopoezin düzenlenmesi, lösemi ve anemi gibi durumlarda klinik öneme sahiptir. Önemlerine rağmen, HSC’ler ve MPP’ler hematopoetik sistemdeki en nadir hücreler arasındadır. Tek bir fareden, tipik olarak, yaklaşık 5000 HSCizole edilebilir 7,8,9. Geleneksel metabolomik yöntemler daha fazla girdi materyali gerektirdiğinden, nadir hücre tiplerini analiz etmek için genellikle birden fazla fareden alınan hücrelerin toplanması gerekliydi10,11.
Burada, tek bir farenin HSC’lerinden metabolomik verilerin üretilmesini sağlamak için numune başına 5000 hücrede metabolitlerin ölçülmesini sağlayan bir protokol geliştirmeyi amaçladık12. Aynı zamanda, bu yöntem, lenfositler gibi daha bol hücre tipleri için tek bir fareden birden fazla kopya oluşturmaya izin verir. Bu yaklaşım, belirli bir proje için gereken hayvan sayısını azaltır, böylece hayvan deneylerinin “3R” (azaltma, değiştirme, iyileştirme) özelliğine katkıda bulunur.
Hücrelerdeki metabolitler, genellikle saniye mertebesinde çok yüksek devir oranlarına sahip olabilir13. Bununla birlikte, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için numunelerin hazırlanması saatler sürebilir ve FACS sıralamasının kendisi dakikalar ila saatler sürebilir ve bu da fizyolojik olmayan koşullar nedeniyle metabolomda potansiyel değişikliklere yol açabilir. Bu protokolde kullanılan bazı reaktifler (amonyum-klorür-potasyum [ACK] lizis tamponu gibi) benzer etkilere sahip olabilir. Bu koşullar hücresel strese neden olabilir ve hücrelerdeki metabolitlerin seviyelerini ve oranlarını etkileyerek hücresel metabolizmanın yanlış veya önyargılı ölçümlerine yol açabilir 14,15,16. Numune hazırlamaya bağlı metabolik değişiklikler bazen tasnif artefaktları olarak adlandırılır. Sert veya sert dokulardan tek hücreli süspansiyonlar üretmek için gerekli olabilecek uzun sindirim protokolleri ve sert reaktifler bu sorunu daha da kötüleştirebilir. Hangi değişikliklerin meydana gelebileceği muhtemelen hücre tipine ve işlem durumuna bağlıdır. Canlı dokudaki bozulmamış hücrelerin metabolik durumu ölçülemediğinden, değişikliklerin kesin doğası bilinmemektedir.
Burada sunulan protokol, geleneksel yöntemlere kıyasla birkaç önemli farklılık içerir, yani kılıf sıvısı olarak 5 g/L NaCl kullanımı, doğrudan ekstraksiyon tamponuna ayırma, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (HILIC-MS) üzerine büyük numune hacimlerinin enjekte edilmesi ve hedeflenen miktar tayininin kullanılması, dahili standartların ve arka plan kontrollerinin titiz kullanımı (Şekil 1). Bu protokol, hücre tipleri arasındaki ve ilaç tedavisi ile araç kontrolü arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruma potansiyeline sahiptir12. Kültürlenmiş hücreler için bile, daha yerleşik santrifüjleme ve süpernatantın manuel olarak çıkarılması gibi alternatif yaklaşımlarla olumlu bir şekilde karşılaştırılır. Ancak, sıralama yapıtları yine de gerçekleşebileceğinden, veriler dikkatle yorumlanmalıdır. Bu sınırlamaya rağmen, protokol, nadir birincil hücrelerde hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin veren metabolik profilleme alanında önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir12.
Nadir birincil hücrelerde geniş metabolik profilleri sağlam bir şekilde ölçme yeteneği, bu hücreleri içeren biyomedikal araştırmalarda yeni deneylere kapı açar. Örneğin, HSC’lerde metabolik aracılı düzenlemenin, anemi ve lösemi için etkileri olan uyku halinin kendini yenileme kapasitesini etkilediği gösterilmiştir11,17. Hasta kaynaklı dolaşımdaki tümör hücrelerinde, tümör ve komşu hücreler arasındaki metabolik genlerin ekspresyonunda farklılıklar gösterilmiştir18,19. Bu protokol şimdi araştırmacıların bu farklılıkları sistematik olarak metabolik düzeyde incelemelerine izin veriyor, bu da genellikle hücresel fenotipe gen ekspresyonundan daha yakın olarak kabul ediliyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolü kullanarak hedeflenen metabolomiklerin başarılı bir şekilde uygulanması için en kritik adımlar şunlardır: 1) temiz hücre popülasyonları sağlayacak sağlam bir boyama ve geçit stratejisi 2) sıvı hacimlerinin hassas bir şekilde işlenmesi, 3) tüm deneysel adımların tekrarlanabilir zamanlaması, özellikle metabolit ekstraksiyonundan önceki tüm adımlar. İdeal olarak, bir deneye ait tüm numuneler, parti etkilerini en aza indirmek için tek bir partide işlenmeli ve ölçülmelidir<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan hayvanları sağladıkları için Max Planck İmmünobiyoloji ve Epigenetik Enstitüsü’nün hayvan tesisine teşekkür eder.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
