Generering av njurorganoider i suspension från inducerade pluripotenta stamceller
Summary
Detta protokoll presenterar en omfattande och effektiv metod för att producera njurorganoider från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) med hjälp av suspensionsodlingsförhållanden. Den primära tyngdpunkten i denna studie ligger i bestämningen av den initiala celltätheten och koncentrationen av WNT-agonisten, vilket gynnar forskare som är intresserade av forskning om njurorganoider.
Abstract
Njurorganoider kan genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) genom olika metoder. Dessa organoider är mycket lovande för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och potentiella terapeutiska tillämpningar. Den här artikeln presenterar en steg-för-steg-procedur för att skapa njurorganoider från iPSC, från den bakre primitiva strimman (PS) till den intermediära mesodermen (IM). Tillvägagångssättet bygger på APEL 2-mediet, som är ett definierat, djurkomponentfritt medium. Det kompletteras med en hög koncentration av WNT-agonist (CHIR99021) under en period av 4 dagar, följt av fibroblasttillväxtfaktor 9 (FGF9)/heparin och en låg koncentration av CHIR99021 under ytterligare 3 dagar. Under denna process läggs tonvikten på att välja den optimala celltätheten och CHIR99021 koncentrationen i början av iPSCs, eftersom dessa faktorer är avgörande för framgångsrik generering av njurorganoider. En viktig aspekt av detta protokoll är suspensionskulturen i en platta med låg vidhäftning, vilket gör att IM gradvis kan utvecklas till nefronstrukturer, som omfattar glomerulära, proximala tubulära och distala tubulära strukturer, allt presenterat i ett visuellt begripligt format. Sammantaget erbjuder detta detaljerade protokoll en effektiv och specifik teknik för att producera njurorganoider från olika iPSC:er, vilket säkerställer framgångsrika och konsekventa resultat.
Introduction
Njuren spelar en avgörande roll för att upprätthålla fysiologisk homeostas, beroende på dess funktionella enhet. Nefroner, som utsöndrar slaggprodukter, kan reglera sammansättningen av kroppsvätskor. Kronisk njursjukdom (CKD), som orsakas av ärftliga mutationer eller andra högriskfaktorer, kommer så småningom att utvecklas till njursjukdom i slutstadiet (ESKD)1,2. ESKD beror tydligen på nefronernas begränsade regenereringsförmåga. Njurersättningsterapi krävs därför. Riktad differentiering av humana iPSCs möjliggör in vitro-generering av patientspecifika 3D-njurorganoider, som kan användas för att studera njurutveckling, modellera patientspecifika sjukdomar och utföra screening av nefrotoxiska läkemedel 3,4.
Under embryonal utveckling härstammar njurarna från den intermediära mesodermen (IM), som skiljer sig från den primitiva strimman (PS). Den klassiska WNT-signalvägen kan inducera ytterligare differentiering av IM med samordnat deltagande av FGF (FGF9, FGF20) och BMP (Bmp7-signalering genom JNK)5,6,7. De producerar två viktiga cellpopulationer av nefriska stamceller (NPC): urinledarknoppen (UB) och metanefriskisenkymet (MM), som bildar uppsamlingskanalerna respektivenefronen 8,9. Varje nefron består av glomerulära och rörformiga segment, såsom de proximala och distala tubuli, och öglan av Henle10,11. Enligt den teori som nämns ovan efterliknar för närvarande publicerade protokoll signalkaskader och tillväxtfaktorstimulering för att inducera njurorganoider 5,12.
Under de senaste åren har många protokoll utvecklats för att differentiera humana iPSCs till njurorganoider 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimerade varaktigheten av CHIR (WNT-agonist) behandling innan den ersattes med FGF9. Enligt deras protokoll är HIR-exponering i 4 dagar, följt av FGF9 i 3 dagar, det mest effektiva sättet att inducera IM från iPSCs. Transwell-filter användes som odlingsformat i deras procedur; Denna metod är dock svår för nybörjare. Därför försökte Kumar et al.13 ändra kulturformatet och valde att avbryta kulturen. De dissocierade de vidhäftande cellerna på dag 7 för sådd i lågvidhäftande plattor för att hjälpa dem att samlas till embryoidkroppar (EB) som innehåller nefronliknande strukturer. Batcheffekten av dessa metoder var dock tydlig, särskilt i olika iPSC:er. Dessutom rapporterade olika litteratur att koncentrationen av CHIR varierade från 7 μM till 12 μM 5,13,14.
Vi spekulerade i att koncentrationen av celldensitet och CHIR kan påverka genereringen av organoider i olika iPSC, och detta har verifierats flera gånger i våra experiment. Det nuvarande protokollet har modifierat studiemetoden för Kumar et al.13 något och gett användarna en steg-för-steg-procedur. Tidsplanen och schemat för inflygningen visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett detaljerat protokoll har beskrivits för att generera njurorganoider från iPSCs, vilket innebär mindre modifieringar av det basala mediet, initial celldensitet och koncentration av CHIR99021. I olika experiment visade sig de kritiska faktorerna för framgångsrik generering av njurorganoider vara den initiala differentieringen av den intermediära mesodermen (IM) och celltillståndet på dag 7. Dessutom uppvisade olika iPSC-linjer variationer i cellproliferation och differentieringspotential, vilket resulterade i v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är oerhört tacksamma till alla Mao och Hu Lab-medlemmar, tidigare och nuvarande, för de intressanta diskussionerna och de stora bidragen till projektet. Vi tackar National Clinical Research Center for Child Health för det stora stödet. Denna studie finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 till Jianhua Mao, 82200784 till Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 till Lidan Hu) och den naturvetenskapliga stiftelsen i Jiangsuprovinsen (anslag nr. BK20210150 till Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Biologie du développement. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
