人脱落乳牙免疫表型间充质干细胞的单细胞分选
Summary
该协议描述了使用单细胞分选方法对人间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的使用。具体而言，当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，使用单细胞分选可以实现来自异质群体的免疫表型细胞的 99% 纯度。
Abstract
生物体的间充质干细胞 （MSC） 具有非凡的能力，可以在体内分化成多种成体细胞谱系，并以其免疫调节和抗炎特性而闻名。这些干细胞的使用对再生生物学领域来说是一个福音，但同时也是再生医学和治疗学的祸根，因为与它们相关的多种细胞模糊性。这些模糊性可能源于这些干细胞来源的多样性和它们的 体外 生长条件，这两者都反映了它们的功能异质性。
这就需要为治疗应用提供纯化、均质的间充质干细胞群体的方法。流式细胞术领域的进步使得使用多参数方法检测单细胞群成为可能。该协议概述了一种通过荧光辅助单细胞分选从人脱落乳牙（SHED）中鉴定和纯化干细胞的方法。同时表达表面标志物，即 CD90-异硫氰酸荧光素 （FITC）、CD73-peridinin-叶绿素蛋白 （PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白 （APC） 和 CD44-V450，使用多参数流式细胞术鉴定了 MSC 的“明亮”阳性表达基因。然而，从第 7 次传代到后来的传代，观察到这些阳性标志物的四重表达者的百分比显着下降。
使用单细胞分型模式对免疫表型亚群进行分选，其中只有两个阳性标记物和一个阴性标记物构成纳入标准。该方法确保了分选群体的细胞活力，并在分选后保持细胞增殖。这种分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该方法可以应用于其他单细胞系统，以改善分离条件并获取多个细胞表面标记物信息。
Introduction
间充质干细胞（MSCs）可以被视为适用于细胞疗法的可扩展细胞来源，可以被认为是再生医学的金标准系统。这些细胞可以从体内具有不同组织来源的各种来源中分离出来1.根据其来源组织，每种类型的间充质干细胞都表现出模棱两可的体外行为2。这在它们的形态和功能特性中得到了很好的观察3.多项研究表明，间充质干细胞的克隆内变异，包括成体组织分化、基因组状态以及代谢和细胞结构 2,4。
细胞免疫表型分析一直是流式细胞术鉴定干细胞的常见应用，国际细胞和基因治疗学会 （ISCT） 于 2006 年利用它来规定将细胞识别为 MSC 的最低标准列表。它指出，除了可塑性粘附和在体外分化为三个谱系（成骨性、成软骨性和产脂性）的能力外，≥95% 的细胞群必须表达 CD105、CD73、CD90，并且这些细胞必须缺乏 CD34、CD45、CD11b、CD14 和 HLA-DR 的表达（≤2% 阳性），如流式细胞术测量的那样5.尽管间充质干细胞是在ISCT的最低标准下由一组生物标志物定义的，但它们的免疫特性无法与这些生物标志物进行基准测试，并且需要超越这些标准，以使交叉研究比较和克隆变异更容易量化2。
尽管 ISCT 制定了指南，但对 MSC 的广泛研究表明，该群体中存在异质性，这可能是由于多种因素造成的，主要是由于 MSC 供体6、组织来源7、克隆群体中的单个细胞8 和培养条件2,9 之间出现的异质性无处不在，10.从各种组织来源中表征和纯化这些原代细胞，以确保质量和细胞命运是其生产的关键步骤。需要了解种群中显示的变异，需要一种有效的方法将其分解为可以单独划分和收集的亚种群11。单细胞水平分析有助于克服细胞间变异的挑战，减少异质性群体产生的生物噪声，并提供研究和表征稀有细胞的能力12。
根据目的和选择的参数，可以采用几种方法来对选定的种群进行排序和富集。细胞分选技术可以包括批量分选和单细胞分选方法。批量分选可以通过磁激活细胞分选 （MACS）13、分馏 14 和洗脱15 富集靶细胞群，而单细胞分选可以通过荧光激活细胞分选 （FACS）11 富集更均匀的细胞群。表1重点介绍了每种方法及其优缺点的比较分析。
表1：不同技术的比较分析：MACS、分馏、洗脱和FACS，突出了其原理的差异以及选择特定技术优于另一种技术的优缺点。 缩写：MACS = 磁活化细胞分选;FACS = 荧光激活的细胞分选。 请按此下载此表格。
自该技术问世以来，单细胞流式细胞术在异质样品17中特定细胞群的计数16、检测和表征中发挥了重要作用。Hewitt 等人于 2006 年奠定了自动细胞分选方法的基础，以增强分化人胚胎干细胞 （hESC） 的均质池的分离18。单细胞分选富集了GFP转导的hESCs群体，促进了转基因克隆的分离，为临床研究开辟了新的维度。为了提高分拣效率，一般采取两种方法;要么修改分选群体的收集培养基以维持分选后细胞的活力和增殖19，要么适当修改细胞分选算法/软件12。
随着技术的进步，商用流式细胞仪和细胞分选仪已经能够帮助解决在无菌分选脆弱和稀有细胞群（尤其是不同来源的干细胞）时遇到的挑战。干细胞生物学家面临的主要挑战之一是按照基因编辑研究所需的转染方案克隆分离人类多能干细胞19。通过将单细胞分选到涂有小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 以及补充剂和商业小分子 ROCK 抑制剂的 96 孔板中来解决此问题。然而，细胞分离策略可以通过使用索引分选来在很大程度上改进，索引分选是分选算法的一个特征，用于识别分选的单个细胞的免疫表型12。这种改进的单细胞分选方式不仅有助于提高干细胞的分选效率，特别是在罕见的造血干细胞群方面，而且还有效地将单细胞克隆与其下游功能测定联系起来20。
本文重点研究对人脱落乳牙（SHEDs）的免疫表型干细胞进行单细胞分选，以富集亚群，研究其功能分化能力。使用两种 MSC 阳性标志物 CD90 和 CD73 以及阴性造血标志物 CD45 的组合，对 MSC 进行免疫表型分析，并鉴定出暗表达子和无效表达子。根据其免疫表型，将亚群鉴定为纯间充质干细胞、单阳性和双阴性群体。使用单细胞分选模式对它们进行分选，以获得纯度和富集的亚群，用于进一步的功能研究，以确定标记物的差异表达是否是 体外 培养条件的产物，或者它是否对功能特性也有任何影响。对不是“阳性MSC标志物”的均质表达者的细胞进行分类，以研究其功能特性。
Protocol
Representative Results
Discussion
在组织工程和再生医学领域，在出生后来源中，口腔组织来源的间充质干细胞因其最小的伦理义务和显着的多谱系分化潜力而引起了人们的极大兴趣21。来自受影响的第三磨牙和 SHED 的牙髓干细胞 （DPSC） 因其在神经退行性疾病和创伤性疾病中的治疗潜力而在牙科间充质干细胞中获得了最多的关注22.本手稿中描述的方案有助于使用多参数方法表征 SHED，并使用单…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢位于印度班加罗尔的贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心的流通池设施使用流式细胞术核心设施。分化细胞沉淀培养物的冷冻切片在印度班加罗尔的 Neuberg Anand 参考实验室进行。这项工作得到了印度马尼帕尔高等教育学院（MAHE）的UC校内资助。AG感谢MAHE的T. M. A. Pai博士奖学金的支持。
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
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