Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.
Abstract
Die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) eines Organismus besitzen eine außergewöhnliche Fähigkeit, sich in mehrere Linien adulter Zellen im Körper zu differenzieren und sind für ihre immunmodulatorischen und entzündungshemmenden Eigenschaften bekannt. Die Verwendung dieser Stammzellen ist ein Segen für das Gebiet der regenerativen Biologie, aber gleichzeitig ein Fluch für die regenerative Medizin und Therapeutika, da sie mit zahlreichen zellulären Mehrdeutigkeiten verbunden sind. Diese Mehrdeutigkeiten können sich aus der Vielfalt der Quelle dieser Stammzellen und aus ihren In-vitro-Wachstumsbedingungen ergeben, die beide ihre funktionelle Heterogenität widerspiegeln.
Dies erfordert Methoden, um gereinigte, homogene Populationen von MSCs für therapeutische Anwendungen bereitzustellen. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie haben den Nachweis von Einzelzellpopulationen mit einem multiparametrischen Ansatz ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt einen Weg zur Identifizierung und Reinigung von Stammzellen aus menschlichen exfolierten Milchzähnen (SHEDs) durch fluoreszenzgestützte Einzelzellsortierung. Die gleichzeitige Expression von Oberflächenmarkern, nämlich CD90-Fluoresceinisothiocyanat (FITC), CD73-Peridin-Chlorophyll-Protein (PerCP-Cy5.5), CD105-Allophycocyanin (APC) und CD44-V450, identifizierte die “hellen”, positiven Exprimatoren von MSCs mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie. Es wurde jedoch ein signifikanter Rückgang des Prozentsatzes der vierfachen Exprimatoren dieser positiven Marker von Passage 7 bis zu den späteren Passagen beobachtet.
Die immunphänotypisierten Subpopulationen wurden im Einzelzell-Sortiermodus sortiert, wobei nur zwei positive und ein negativer Marker die Einschlusskriterien darstellten. Diese Methodik stellte die Zelllebensfähigkeit der sortierten Populationen sicher und hielt die Zellproliferation nach der Sortierung aufrecht. Die nachgeschaltete Anwendung für eine solche Sortierung kann verwendet werden, um die linienspezifische Differenzierung für die abgegrenzten Teilpopulationen zu evaluieren. Dieser Ansatz kann auf andere Einzelzellsysteme angewendet werden, um die Isolationsbedingungen zu verbessern und Informationen über mehrere Zelloberflächenmarker zu erhalten.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) können als skalierbare Zellquelle angesehen werden, die für zellbasierte Therapien geeignet ist, und können als Goldstandardsystem in der regenerativen Medizin angesehen werden. Diese Zellen können aus einer Vielzahl von Quellen im Körper mit unterschiedlicher Gewebeherkunft isoliert werden1. Abhängig von ihrem Ausgangsgewebe zeigt jede Art von MSC ein mehrdeutiges In-vitro-Verhalten 2. Dies zeigt sich gut in ihren morphologischen und funktionellen Eigenschaften3. Mehrere Studien haben intraklonale Variationen in den Dimensionen gezeigt, einschließlich der Differenzierung von adultem Gewebe, des genomischen Zustands sowie der metabolischen und zellulären Architektur von MSCs 2,4.
Die Immunphänotypisierung von Zellen ist eine gängige Anwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Stammzellen und wurde 2006 von der Internationalen Gesellschaft für Zell- und Gentherapie (ISCT) genutzt, um eine Liste von Mindestkriterien zur Identifizierung von Zellen als MSCs vorzuschreiben. Darin heißt es, dass neben der plastischen Adhärenz und der Fähigkeit, sich in drei Linien (osteogen, chondrogen und adipogen) in vitro zu differenzieren, ≥95 % der Zellpopulation CD105, CD73 und CD90 exprimieren müssen, und diesen Zellen muss die Expression (≤2 % positiv) von CD34, CD45, CD11b, CD14 und HLA-DR fehlen, gemessen durch Durchflusszytometrie5. Obwohl die MSCs durch eine Reihe von Biomarkern nach den Minimalkriterien des ISCT definiert wurden, konnten ihre Immuneigenschaften nicht mit diesen Biomarkern verglichen werden, und es bestand ein Bedarf an weiteren über diese Kriterien hinausgehenden Kriterien, um studienübergreifende Vergleiche und klonale Variationen leichter quantifizierbar zu machen2.
Trotz der vom ISCT festgelegten Richtlinien haben umfangreiche Forschungen zu MSCs gezeigt, dass in dieser Population Heterogenität besteht, die auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen sein könnte, hauptsächlich aufgrund der Allgegenwart der Heterogenität, die zwischen MSC-Spendern6, Gewebequellen7, einzelnen Zellen innerhalb einer klonalen Population8 und den Kulturbedingungen 2,9 entsteht. 10. Anmelden Die Charakterisierung und Reinigung dieser Primärzellen aus einer Vielzahl von Gewebequellen, um die Qualität und das Zellschicksal sicherzustellen, sind wichtige Schritte bei ihrer Herstellung. Die Notwendigkeit, die angezeigten Variationen innerhalb der Grundgesamtheit zu verstehen, erfordert eine effiziente Methode, um sie in Teilpopulationen aufzulösen, die unterteilt und separat gesammelt werden können11. Analysen auf Einzelzellebene tragen dazu bei, die Herausforderungen der Zell-Zell-Variation zu überwinden, das biologische Rauschen zu reduzieren, das durch eine heterogene Population entsteht, und bieten die Möglichkeit, seltene Zellen zu untersuchen und zu charakterisieren12.
Basierend auf dem Zweck und den gewählten Parametern können verschiedene Methoden angewendet werden, um die ausgewählten Populationen zu sortieren und anzureichern. Zellsortiertechniken können sowohl Massensortier- als auch Einzelzellensortierverfahren umfassen. Während die Massensortierung Zielpopulationen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)13, Fraktionierung 14 und Elutriation15 anreichern kann, kann die Einzelzellsortierung homogenere Populationen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)11 anreichern. Eine vergleichende Analyse jeder dieser Methoden mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Vergleichende Analysen verschiedener Techniken: MACS, Fraktionierung, Elutriation und FACS, wobei die Unterschiede in ihrem Prinzip und die Vor- und Nachteile der Wahl einer bestimmten Technik gegenüber einer anderen hervorgehoben werden. Abkürzungen: MACS = Magnetisch aktivierte Zellsortierung; FACS = Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Seit dem Aufkommen der Technik spielt die Einzelzell-Durchflusszytometrie eine wichtige Rolle bei der Zählung16, dem Nachweis und der Charakterisierung einer spezifischen Zellpopulation in einer heterogenen Probe17. Hewitt et al. legten 2006 den Grundstein für eine automatisierte Zellsortierungsmethode, um die Isolierung homogener Pools differenzierter humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) zu verbessern18. Die Einzelzellsortierung reicherte die Population der GFP-transduzierten hES-Zellen an und erleichterte die Isolierung genetisch veränderter Klone, was eine neue Dimension in der klinischen Forschung eröffnete. Um die Sortiereffizienz zu verbessern, wurden im Allgemeinen zwei Ansätze gewählt; Entweder werden die Sammelmedien der sortierten Populationen modifiziert, um die Lebensfähigkeit und Proliferation der nachsortierten Zellen19 aufrechtzuerhalten, oder der Zellsortierungsalgorithmus/die Zellsortierungssoftware wird entsprechend modifiziert12.
Mit dem technologischen Fortschritt konnten kommerzielle Durchflusszytometer und Zellsortierer dazu beitragen, Herausforderungen zu bewältigen, die bei der aseptischen Sortierung fragiler und seltener Zellpopulationen, insbesondere Stammzellen unterschiedlicher Herkunft, bewältigt wurden. Eine der größten Herausforderungen für Stammzellbiologen war die klonale Isolierung menschlicher pluripotenter Stammzellen nach Transfektionsprotokollen, die in Gen-Editing-Studien erforderlich sind19. Dies wurde durch die Sortierung einzelner Zellen in 96-Well-Platten gelöst, die mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus zusammen mit Nahrungsergänzungsmitteln und kommerziellen niedermolekularen ROCK-Inhibitoren beschichtet wurden. Die Strategien zur Zellisolierung konnten jedoch durch die Verwendung der Indexsortierung, einer Funktion des Sortieralgorithmus, die den Immunphänotyp einzelner sortierter Zellen identifiziert, weitgehend verfeinert werden12. Diese verfeinerte Modalität in der Einzelzellsortierung trug nicht nur dazu bei, die Sortiereffizienz von Stammzellen zu verbessern, insbesondere im Hinblick auf seltene hämatopoetische Stammzellpopulationen, sondern verknüpfte auch Einzelzellklone effizient mit ihren nachgeschalteten funktionellen Assays20.
Diese Arbeit konzentriert sich auf die Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten Stammzellen aus menschlichen exfolierten Milchzähnen (SHEDs) zur Anreicherung von Subpopulationen, um ihre funktionellen Differenzierungsfähigkeiten zu untersuchen. Mit einer Kombination aus zwei MSC-positiven Markern, CD90 und CD73, und einem negativen hämatopoetischen Marker CD45 wurden die MSCs immunphänotypisiert und die Dim- und Null-Expressionoren identifiziert. Basierend auf ihrem Immunphänotyp wurden die Subpopulationen als reine MSCs, einfach positive und doppelt negative Populationen identifiziert. Sie wurden im Einzelzell-Sortiermodus sortiert, um reine und angereicherte Subpopulationen für weitere funktionelle Studien zu erhalten, um festzustellen, ob die differentielle Expression von Markern ein Artefakt der In-vitro-Kulturbedingungen ist oder ob sie auch einen Einfluss auf die funktionellen Eigenschaften hat. Zellen, die keine homogenen Exprimatoren der “positiven MSC-Marker” waren, wurden sortiert, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin haben unter den postnatalen Quellen aus oralem Gewebe gewonnene MSCs aufgrund ihrer minimalen ethischen Verpflichtungen und ihres bemerkenswerten Multilineage-Differenzierungspotenzials großes Interesse geweckt21. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus dem betroffenen dritten Molaren und SHEDs haben aufgrund ihres therapeutischen Potenzials bei neurodegenerativen und traumatischen Erkrankungen die größte Aufmerksamkeit unter dentale…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Flow Cell Facility am Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Indien, für die Nutzung der Core Facility für Durchflusszytometrie. Der Kryoschnitt der Pelletkultur differenzierter Zellen wurde am Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Indien, durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch die interne Finanzierung der UC durch die Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Indien, unterstützt. AG bedankt sich für die Unterstützung durch das Dr. T. M. A. Pai Stipendium von MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
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