인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류
Summary
이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.
Abstract
유기체의 중간엽 줄기세포(MSC)는 체내에서 여러 계통의 성체 세포로 분화할 수 있는 특별한 능력을 가지고 있으며 면역 조절 및 항염증 특성으로 알려져 있습니다. 이러한 줄기 세포의 사용은 재생 생물학 분야에 도움이 되지만 동시에 이와 관련된 여러 세포 모호성으로 인해 재생 의학 및 치료제에 골칫거리가 됩니다. 이러한 모호성은 줄기세포의 출처의 다양성과 체외 성장 조건에서 발생할 수 있으며, 둘 다 기능적 이질성을 반영합니다.
이는 치료 응용 분야를 위해 정제된 균질한 MSC 집단을 제공하는 방법론을 보증합니다. 유세포 분석 분야의 발전으로 다중 파라미터 접근법을 사용하여 단일 세포 집단을 검출할 수 있게 되었습니다. 이 프로토콜은 형광 보조 단일 세포 분류를 통해 인간 박리 낙엽 치아(SHED)에서 줄기 세포를 식별하고 정제하는 방법을 설명합니다. 표면 마커, 즉 CD90-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), CD73-페리디닌-엽록소-단백질(PerCP-Cy5.5), CD105-알로피코시아닌(APC) 및 CD44-V450의 동시 발현은 다중 파라미터 유세포 분석을 사용하여 MSC의 “밝은” 양성 발현체를 식별했습니다. 그러나 7번 구절부터 이후 구절까지 이러한 양성 마커의 4중 표현자의 비율이 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다.
면역표현형 하위집단은 2개의 양성 마커와 1개의 음성 마커만 포함 기준을 구성하는 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. 이 방법론은 분류된 집단의 세포 생존력을 보장하고 분류 후 세포 증식을 유지했습니다. 이러한 분류를 위한 다운스트림 응용 프로그램은 제어된 하위 모집단에 대한 계통별 분화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 분리 조건을 개선하고 다중 세포 표면 마커 정보를 획득하기 위해 다른 단일 세포 시스템에 적용될 수 있습니다.
Introduction
중간엽 줄기 세포(MSC)는 세포 기반 치료에 적합한 확장 가능한 세포 공급원으로 간주될 수 있으며 재생 의학의 황금 표준 시스템으로 간주될 수 있습니다. 이 세포는 조직 기원이 다른 신체의 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다1. 소스 조직에 따라 각 유형의 MSC는 모호한 in vitro 거동을 나타낸다 2. 이것은 형태학적, 기능적 특성에서 잘 관찰된다3. 여러 연구에서 MSC2,4의 성인 조직 분화, 게놈 상태, 대사 및 세포 구조를 포함한 차원의 클론 내 변이가 나타났습니다.
세포의 면역표현형은 줄기세포 식별을 위한 유세포 분석의 일반적인 응용 분야였으며 2006년 국제 세포 및 유전자 치료 학회(ISCT)에서 세포를 MSC로 식별하기 위한 최소 기준 목록을 처방하는 데 활용되었습니다. 이 연구는 체 외에서 플라스틱 부착 및 세 가지 계통(골형성, 연골형성, 지방형성)으로 분화할 수 있는 능력과 함께 세포 집단의 ≥95%가 CD105, CD73, CD90을 발현해야 하며, 이러한 세포는 유세포분석으로 측정한 CD34, CD45, CD11b, CD14 및 HLA-DR의 발현(≤2% 양성)이 부족해야 한다고 밝혔습니다 5. MSC는 ISCT의 최소 기준에 따라 일련의 바이오마커로 정의되었지만, 이러한 바이오마커로 면역 특성을 벤치마킹할 수 없었으며, 연구 간 비교 및 클론 변이를 더 쉽게 정량화하기 위해 이러한 기준을 넘어서는 것이 필요했습니다2.
ISCT가 정한 지침에도 불구하고, MSC에 대한 광범위한 연구는 이 집단에 이질성이 존재한다는 것을 보여주었으며, 이는 주로 MSC 공여체6, 조직 공급원7,클론 집단 내의 개별 세포8 및 배양 조건 2,9 사이에서 발생하는 이질성의 유비쿼터스 특성으로 인해 발생할 수 있는 다양한 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 10. 다양한 조직 공급원에서 이러한 일차 세포의 특성 분석 및 정제를 통해 품질과 세포 운명을 보장하는 것이 생산의 핵심 단계입니다. 모집단 간에 나타난 변이를 이해하기 위해서는 이를 별도로 나누고 수집할 수 있는 하위 모집단으로 해석하는 효율적인 방법이 필요하다11. 단일 세포 수준 분석은 세포 간 변이의 문제를 극복하고, 이질적인 집단에서 발생하는 생물학적 노이즈를 줄이며, 희귀 세포를 조사하고 특성화할 수 있는 기능을 제공합니다12.
목적과 선택한 매개변수에 따라 선택한 모집단을 정렬하고 보강하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 세포 분류 기술은 벌크 분류 및 단일 세포 분류 방법 모두를 포함할 수 있습니다. 벌크 분류는 자기 활성화 세포 분류(MACS)13, 분획14 및 용출15을 통해 표적 집단을 농축할 수 있는 반면, 단일 세포 분류는 형광 활성화 세포 분류(FACS)11를 통해 보다 균질한 집단을 농축할 수 있습니다. 이러한 각 방법의 장점과 단점을 비교 분석한 것이 표 1에 강조 표시되어 있습니다.
표 1: 다양한 기법의 비교 분석: MACS, 분획, 용출 및 FACS는 원리의 차이점과 특정 기법을 다른 기법보다 선택할 때의 장단점을 강조합니다. 약어: MACS = 자기 활성화 세포 분류; FACS = 형광 활성화 세포 분류. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
이 기법의 출현 이후로, 단세포 유세포분석법은 이종 샘플(17)에서 특정 세포 집단의 열거(enumeration)16, 검출 및 특성화(characterization)에 중요한 역할을 해왔다. 2006년 Hewitt et al.은 분화된 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 균질한 풀의 분리를 강화하기 위해 자동화된 세포 분류 방법론의 토대를 마련했습니다18. 단일 세포 분류는 GFP 형질도입 hESC의 집단을 풍부하게 하여 유전자 변형 클론의 분리를 촉진하여 임상 연구의 새로운 차원을 열었습니다. 정렬 효율성을 개선하기 위해 일반적으로 두 가지 접근 방식이 취해졌습니다. 분류된 집단의 수집 배지가 후-분류된 세포(19 )의 생존 및 증식을 유지하기 위해 변형되거나, 세포-분류 알고리즘/소프트웨어가 적절하게 변형되거나(12).
기술의 발전으로 상용 유세포 분석기와 세포 분류기는 깨지기 쉬운 희귀 세포 집단, 특히 기원이 다른 줄기 세포를 무균 분류하는 동안 발생하는 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있었습니다. 줄기세포 생물학자들의 주요 과제 중 하나는 유전자 편집 연구에서 요구되는 형질주입 프로토콜에 따라 인간 만능 줄기세포의 클론 분리였다19. 이 문제는 단일 세포를 보충제 및 상업용 저분자 ROCK 억제제와 함께 마우스 배아 섬유아세포(MEF)로 코팅된 96웰 플레이트로 분류하여 해결되었습니다. 그러나, 세포 분리 전략은 분류된 개별 세포의 면역표현형을 식별하는 분류 알고리즘의 특징인 색인 분류(index sorting)의 사용으로 크게 개선될 수 있다12. 단세포 분류의 이러한 정교한 양식은 특히 희귀 조혈모세포 집단과 관련하여 줄기세포의 분류 효율을 향상시키는 데 도움이 되었을 뿐만 아니라 단세포 클론을 다운스트림 기능 분석에 효율적으로 연결하는 데 도움이 되었습니다20.
이 논문은 기능적 분화 능력을 연구하기 위해 하위 집단의 농축을 위해 인간 박리 낙엽 치아(SHED)에서 면역 표현형 줄기 세포의 단일 세포 분류에 중점을 둡니다. 두 개의 MSC 양성 마커인 CD90 및 CD73과 음성 조혈 마커인 CD45의 조합을 사용하여 MSC를 면역표현형으로 변환하고 dim 및 null 발현자를 식별했습니다. 면역 표현형에 따라 하위 집단은 순수 MSC, 단일 양성 및 이중 음성 집단으로 식별되었습니다. 이들은 마커의 차등 발현이 시험관 내 배양 조건의 인공물인지 또는 기능적 특성에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 추가 기능 연구를 위해 순수하고 농축된 하위 집단을 얻기 위해 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. “양성 MSC 마커”의 균질한 발현체가 아닌 세포를 분류하여 기능적 특성을 연구했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직 공학 및 재생 의학 분야에서, 출생 후 소스 중 구강 조직 유래 MSC는 최소한의 윤리적 의무와 주목할 만한 다중 계통 분화 가능성으로 인해 깊은 관심을 끌었다21. 영향을 받은 제3대구치와 SHED의 치수 줄기세포(DPSC)는 신경퇴행성 및 외상성 질환에 대한 치료 잠재력으로 인해 치과 MSC들 사이에서 가장 주목을 받고 있다22. 이 원고에 설명된 프로토콜은 다중 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
인도 벵갈루루에 있는 Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research의 Flow Cell Facility에 유세포 분석 핵심 시설을 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 분화된 세포의 펠릿 배양물의 동결 절편은 인도 벵갈루루에 있는 Neuberg Anand Reference Laboratory에서 수행되었습니다. 이 작업은 인도 MAHE(Manipal Academy of Higher Education)의 UC 교내 자금 지원을 받았습니다. AG는 MAHE의 Dr. T. M. A. Pai 장학금의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
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