Enkeltcellesortering av immunfenotypede mesenkymale stamceller fra humane eksfolierte løvtenner
Summary
Denne protokollen beskriver bruken av fluorescensaktivert cellesortering av humane mesenkymale stamceller ved bruk av enkeltcellesorteringsmetoden. Spesielt kan bruk av enkeltcellesortering oppnå 99% renhet av immunfenotypede celler fra en heterogen populasjon kombinert med en multiparametrisk flowcytometribasert tilnærming.
Abstract
De mesenkymale stamceller (MSC) i en organisme har en ekstraordinær evne til å differensiere til flere linjer av voksne celler i kroppen og er kjent for deres immunmodulerende og antiinflammatoriske egenskaper. Bruken av disse stamcellene er en velsignelse for feltet regenerativ biologi, men samtidig en bane til regenerativ medisin og terapi på grunn av de mange cellulære tvetydigheter som er forbundet med dem. Disse tvetydighetene kan oppstå fra mangfoldet i kilden til disse stamcellene og fra deres in vitro vekstbetingelser, som begge reflekterer deres funksjonelle heterogenitet.
Dette garanterer metoder for å gi rensede, homogene populasjoner av MSC for terapeutiske anvendelser. Fremskritt innen flowcytometri har gjort det mulig å oppdage enkeltcellepopulasjoner ved hjelp av en multiparametrisk tilnærming. Denne protokollen skisserer en måte å identifisere og rense stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner (SHEDs) gjennom fluorescensassistert enkeltcellesortering. Samtidig ekspresjon av overflatemarkører, nemlig CD90-fluoresceinisotiocyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC) og CD44-V450, identifiserte de “lyse”, positive uttrykkerne av MSC ved bruk av multiparametrisk flowcytometri. Imidlertid ble det observert en signifikant nedgang i prosentandeler av firedoble ekspressorer av disse positive markørene fra passasje 7 og utover til de senere passasjene.
De immunfenotypede subpopulasjonene ble sortert i encellet sorteringsmodus der kun to positive og en negativ markør utgjorde inklusjonskriteriene. Denne metodikken sikret cellenes levedyktighet til de sorterte populasjonene og opprettholdt celleproliferasjon etter sortering. Nedstrømsapplikasjonen for slik sortering kan brukes til å evaluere avstamningsspesifikk differensiering for de inngjerdede delpopulasjonene. Denne tilnærmingen kan brukes på andre enkeltcellesystemer for å forbedre isolasjonsforholdene og for å anskaffe informasjon om flere celleoverflatemarkører.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC) kan betraktes som en skalerbar kilde til celler egnet for cellebaserte terapier og kan betraktes som et gullstandardsystem innen regenerativ medisin. Disse cellene kan isoleres fra en rekke kilder i kroppen med forskjellig vevsopprinnelse1. Avhengig av deres kildevev, viser hver type MSC en tvetydig in vitro-oppførsel 2. Dette er godt observert i deres morfologiske og funksjonelle egenskaper3. Flere studier har vist intraklonal variasjon i dimensjoner, inkludert vevsdifferensiering hos voksne, genomisk tilstand og metabolsk og cellulær arkitektur av MSCs 2,4.
Immunfenotyping av celler har vært en vanlig anvendelse av flowcytometri for identifisering av stamceller, og dette ble brukt av International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) i 2006 for å foreskrive en liste over minimale kriterier for å identifisere celler som MSC. Det uttalte at sammen med plastisk adherens og evnen til å differensiere i tre linjer (osteogen, kondrogen og adipogen) in vitro, må ≥95% av cellepopulasjonen uttrykke CD105, CD73, CD90, og disse cellene må mangle uttrykket (≤2% positivt) av CD34, CD45, CD11b, CD14 og HLA-DR, målt ved flowcytometri5. Selv om MSCene ble definert av et sett med biomarkører under ISCTs minimale kriterier, kunne deres immunegenskaper ikke benchmarkes med disse biomarkørene, og det var behov for mer utover disse kriteriene for å gjøre sammenligninger på tvers av studier og klonale variasjoner lettere å kvantifisere2.
Til tross for retningslinjene satt av ISCT, har omfattende forskning på MSC vist at heterogenitet eksisterer i denne populasjonen, noe som kan oppstå på grunn av en rekke faktorer, hovedsakelig på grunn av den allestedsnærværende naturen av heterogenitet som oppstår mellom MSC-donorer6, vevskilder7, individuelle celler i en klonal populasjon8 og kulturforhold2,9, 10. Karakterisering og rensing av disse primære cellene fra en rekke vevskilder for å sikre kvalitet og celleskjebne er viktige trinn i produksjonen. Behovet for å forstå de viste variasjonene blant populasjonen krever en effektiv metode for å løse den inn i delpopulasjoner som kan deles og samles separat11. Analyser på enkeltcellenivå bidrar til å overvinne utfordringene med cellecellevariasjon, redusere biologisk støy som oppstår fra en heterogen populasjon, og gir muligheten til å undersøke og karakterisere sjeldne celler12.
Basert på formålet og valgte parametere, kan flere metoder brukes til å sortere og berike de utvalgte populasjonene. Cellesorteringsteknikker kan omfatte både bulksortering og enkeltcellesorteringsmetoder. Mens massesortering kan berike målpopulasjoner gjennom magnetisk aktivert cellesortering (MACS)13, fraksjonering 14 og eluering 15, kan enkeltcellesortering berike mer homogene populasjoner ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS)11. En komparativ analyse av hver av disse metodene med egne fordeler og ulemper er fremhevet i tabell 1.
Tabell 1: Komparative analyser av ulike teknikker: MACS, fraksjonering, eluering og FACS som fremhever forskjellene i prinsippet og fordelene og ulempene ved å velge en bestemt teknikk fremfor en annen. Forkortelser: MACS = Magnetisk aktivert cellesortering; FACS = Fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Siden fremkomsten av teknikken har enkeltcelleflowcytometri spilt en viktig rolle i oppregning16, deteksjon og karakterisering av en spesifikk cellepopulasjon i en heterogen prøve17. Hewitt et al. la i 2006 grunnlaget for automatisert cellesorteringsmetodikk for å forbedre isoleringen av homogene bassenger av differensierte humane embryonale stamceller (hESCs)18. Enkeltcellesortering beriket populasjonen av GFP-transduserte hESC-er som letter isoleringen av genmodifiserte kloner, noe som åpnet en ny dimensjon i klinisk forskning. For å forbedre sorteringseffektiviteten er det generelt tatt to tilnærminger; Enten er innsamlingsmediene til de sorterte populasjonene modifisert for å opprettholde levedyktighet og spredning av ettersorterte celler19 eller cellesorteringsalgoritmen / programvaren er hensiktsmessig modifisert12.
Med utviklingen av teknologi har kommersielle strømningscytometre og cellesorterere vært i stand til å bidra til å løse utfordringer som ble møtt mens aseptisk sortering av skjøre og sjeldne cellepopulasjoner, spesielt stamceller av forskjellig opprinnelse. En av de største utfordringene for stamcellebiologer har vært klonal isolering av humane pluripotente stamceller etter transfeksjonsprotokoller som kreves i genredigeringsstudier19. Dette ble adressert ved å sortere enkeltceller i 96-brønnsplater som ble belagt med musembryonale fibroblaster (MEF) sammen med kosttilskudd og kommersielle småmolekylære ROCK-hemmere. Imidlertid kan celleisolasjonsstrategier i stor grad raffineres ved bruk av indekssortering, en funksjon i sorteringsalgoritmen som identifiserer immunfenotypen til individuelle celler sortert12. Denne raffinerte modaliteten i enkeltcellesortering bidro ikke bare til å øke sorteringseffektiviteten for stamceller, spesielt med hensyn til sjeldne hematopoietiske stamcellepopulasjoner, men koblet også effektivt enkeltcellekloner til deres nedstrøms funksjonelle analyser20.
Denne artikkelen fokuserer på enkeltcellesortering av immunfenotypede stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner (SHEDs) for anrikning av underpopulasjoner for å studere deres funksjonelle differensieringskapasitet. Ved hjelp av en kombinasjon av to MSC-positive markører, CD90 og CD73, og en negativ hematopoietisk markør CD45, ble MSC immunfenotypet og dim og null ekspressorer ble identifisert. Basert på deres immunfenotype ble subpopulasjonene identifisert som rene MSC, enkle positive og dobbelt negative populasjoner. De ble sortert ved hjelp av encellesorteringsmodus for å oppnå rene og berikede subpopulasjoner for videre funksjonelle studier for å identifisere om differensialuttrykket av markører var en artefakt av in vitro-kulturforhold eller om det også har noen effekt på de funksjonelle egenskapene. Celler som ikke var homogene uttrykkere av de “positive MSC-markørene” ble sortert for å studere deres funksjonelle egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innen vevsteknikk og regenerativ medisin, blant de postnatale kildene, har orale vevsavledede MSCer tiltrukket dyp interesse på grunn av deres minimale etiske forpliktelser og bemerkelsesverdige multilineage differensieringspotensial21. Dental pulp stamceller (DPSCs) fra den berørte tredje molar og SHEDs har fått mest oppmerksomhet blant dental MSCs for deres terapeutiske potensial i nevrodegenerative og traumatiske sykdommer22. Protokollen beskrevet i dette manuskriptet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Flow Cell Facility ved Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, India, for bruken av kjernefasiliteten for flowcytometri. Kryosnittingen av pelletskulturen av differensierte celler ble utført ved Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, India. Dette arbeidet ble støttet av UCs intramurale finansiering fra Manipal Academy of Higher Education (MAHE), India. AG er takknemlig for støtten fra Dr. T. M. A. Pai-stipendet fra MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- . . FACSAria Fusion User’s Guide. , (2018).
