Isolerede mononukleære celler i perifert blod kan anvendes til analyse af immunfunktioner og lidelser, stofskiftesygdomme eller mitokondriefunktioner. I dette arbejde beskriver vi en standardiseret metode til fremstilling af PBMC’er fra fuldblod og den efterfølgende kryopræservering. Kryopræservering gør denne tid og dette sted uafhængigt.
De fysiologiske funktioner i eukaryote celler er afhængige af energi, der hovedsageligt leveres af mitokondrier. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med metaboliske sygdomme og aldring. Oxidativ fosforylering spiller en afgørende rolle, da det er afgørende for opretholdelsen af energisk homeostase. PBMC’er er blevet identificeret som en minimalt invasiv prøve til måling af mitokondriefunktion og har vist sig at afspejle sygdomstilstande. Imidlertid kan måling af mitokondriel bioenergetisk funktion begrænses af flere faktorer i humane prøver. Begrænsninger er mængden af udtagne prøver, prøvetagningstiden, som ofte er spredt over flere dage, og steder. Kryopræservering af de indsamlede prøver kan sikre ensartet indsamling og måling af prøver. Det bør sikres, at de målte parametre er sammenlignelige mellem kryopræserverede og frisklavede celler. Her beskriver vi metoder til isolering og kryokonservering af PBMC’er fra humane blodprøver for at analysere mitokondriernes bioenergetiske funktion i disse celler. PBMC kryopræserveret i henhold til protokollen beskrevet her viser kun mindre forskelle i celleantal og levedygtighed, adenosintrifosfatniveauer og målt respiratorisk kædeaktivitet sammenlignet med nyhøstede celler. Der kræves kun 8-24 ml humant blod til de beskrevne præparater, hvilket gør det muligt at indsamle prøver under kliniske undersøgelser multicentralt og bestemme deres bioenergetik på stedet.
Humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) anvendes til forskellige anvendelser inden for mange videnskabelige områder, herunder undersøgelse af immunologiske og bioenergetiske spørgsmål, såsom dem, der er relateret til aldringsprocesser eller degenerative sygdomme 1,2. PBMC’er er heterogene i sammensætning og består af lymfocytter (B-celler, T-celler og NK-celler), monocytter og dendritiske celler. Cellerne viser undertiden store individuelle forskelle og variationer inden for et emne, så standardiserede procedurer til håndtering af disse celler er påkrævet. Vigtige parametre som isolationens levedygtighed og renhed er de grundlæggende krav til dens håndtering og påvirkes desuden af miljøfaktorer som indsamlingstidspunktet, melatoninniveauet, om emnet faster og andre 3,4.
Baseret på undersøgelser af PBMC’ers bioenergetik beskriver vi her en metode til isolering, kryopræservering og dyrkning af PBMC’er, der også er egnet til andre metoder. Mens muskelbiopsi betragtes som guldstandarden for mitokondriel energimetabolisme5, er undersøgelsen af blodlegemer en hurtig, minimalt invasiv procedure. Derudover tyder flere og flere undersøgelser på, at ændringerne i mitokondriefunktionen i aldring og Alzheimers sygdom (AD) forekommer ikke kun i hjernen, men også i periferien 6,7,8,9,10. Metoden tillader også undersøgelser af andre tilstande og sygdomme, herunder diabetes mellitus og fedme 11,12,13. Genekspressionsmønstre hos patienter med multipel sklerose kan analyseres, eller immunfunktion og påvirkninger på det generelt 14,15,16.
PBMC’er er generelt afhængige af oxidativ phosphorylering (OXPHOS) for at generere adenosintrifosfat (ATP)17,18. Derfor dækker PBMC’er en bred vifte af applikationer som surrogater. I tidligere rapporter er PBMC’ernes energimetabolisme blevet brugt til at behandle organdysfunktioner, såsom ved tidlig hjertesvigt19, septisk chok20 eller kønsrelaterede forskelle4 i mitokondriefunktion. En generaliseret metode til kryopræservering, isolering og dyrkning af PBMC’er ville have fordele ved sammenligneligheden af resultater opnået på forskellige institutter. Der er stor variation i protokollerne for hvert trin21,22, målet med denne metode er at give en retningslinje for bioenergetiske målinger i PBMC’er.
I denne artikel beskriver vi en metode til måling af bioenergetiske parametre i PBMC’er. Vi forklarer metoderne til isolering, kryokonservering og måling af bioenergetik af PBMC’er fra humant blod. Denne metode kan bruges til at bestemme bioenergetiske parametre hos patienter og evaluere dem i en klinisk sammenhæng. For at anvende disse målinger har forskere brug for adgang til en patientpopulation, hvorfra friske blodprøver kan fås.
Denne protokol giver mulighed for at isolere og kryobevare mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) fra humant blod på en måde, der er egnet til bioenergetiske analyser. Den beskrevne metode giver mulighed for at isolere PBMC’er forsigtigt og i store mængder med høj levedygtighed og tilstrækkelige celler til bioenergetiske målinger. Det har den ulempe, at selv med minimale afbrydelser forekommer lange isolationer, men efterfølgende kryopræservering muliggør en tidsuafhængig måling af bioenergetik. Med de…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke det kliniske team på universitetshospitalet Giessen-Marburg for blodindsamlingen. Dette arbejde blev finansieret af Justus Liebig-universitetet.
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
Disinfection spray | |||
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Holder/adapter | |||
Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Injection syringe | Hamilton | ||
Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
MIR05 | Self-prepared | – | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |