Kryopræservering og bioenergetisk evaluering af humane mononukleære celler i perifert blod
Summary
Isolerede mononukleære celler i perifert blod kan anvendes til analyse af immunfunktioner og lidelser, stofskiftesygdomme eller mitokondriefunktioner. I dette arbejde beskriver vi en standardiseret metode til fremstilling af PBMC’er fra fuldblod og den efterfølgende kryopræservering. Kryopræservering gør denne tid og dette sted uafhængigt.
Abstract
De fysiologiske funktioner i eukaryote celler er afhængige af energi, der hovedsageligt leveres af mitokondrier. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med metaboliske sygdomme og aldring. Oxidativ fosforylering spiller en afgørende rolle, da det er afgørende for opretholdelsen af energisk homeostase. PBMC’er er blevet identificeret som en minimalt invasiv prøve til måling af mitokondriefunktion og har vist sig at afspejle sygdomstilstande. Imidlertid kan måling af mitokondriel bioenergetisk funktion begrænses af flere faktorer i humane prøver. Begrænsninger er mængden af udtagne prøver, prøvetagningstiden, som ofte er spredt over flere dage, og steder. Kryopræservering af de indsamlede prøver kan sikre ensartet indsamling og måling af prøver. Det bør sikres, at de målte parametre er sammenlignelige mellem kryopræserverede og frisklavede celler. Her beskriver vi metoder til isolering og kryokonservering af PBMC’er fra humane blodprøver for at analysere mitokondriernes bioenergetiske funktion i disse celler. PBMC kryopræserveret i henhold til protokollen beskrevet her viser kun mindre forskelle i celleantal og levedygtighed, adenosintrifosfatniveauer og målt respiratorisk kædeaktivitet sammenlignet med nyhøstede celler. Der kræves kun 8-24 ml humant blod til de beskrevne præparater, hvilket gør det muligt at indsamle prøver under kliniske undersøgelser multicentralt og bestemme deres bioenergetik på stedet.
Introduction
Humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) anvendes til forskellige anvendelser inden for mange videnskabelige områder, herunder undersøgelse af immunologiske og bioenergetiske spørgsmål, såsom dem, der er relateret til aldringsprocesser eller degenerative sygdomme 1,2. PBMC’er er heterogene i sammensætning og består af lymfocytter (B-celler, T-celler og NK-celler), monocytter og dendritiske celler. Cellerne viser undertiden store individuelle forskelle og variationer inden for et emne, så standardiserede procedurer til håndtering af disse celler er påkrævet. Vigtige parametre som isolationens levedygtighed og renhed er de grundlæggende krav til dens håndtering og påvirkes desuden af miljøfaktorer som indsamlingstidspunktet, melatoninniveauet, om emnet faster og andre 3,4.
Baseret på undersøgelser af PBMC’ers bioenergetik beskriver vi her en metode til isolering, kryopræservering og dyrkning af PBMC’er, der også er egnet til andre metoder. Mens muskelbiopsi betragtes som guldstandarden for mitokondriel energimetabolisme5, er undersøgelsen af blodlegemer en hurtig, minimalt invasiv procedure. Derudover tyder flere og flere undersøgelser på, at ændringerne i mitokondriefunktionen i aldring og Alzheimers sygdom (AD) forekommer ikke kun i hjernen, men også i periferien 6,7,8,9,10. Metoden tillader også undersøgelser af andre tilstande og sygdomme, herunder diabetes mellitus og fedme 11,12,13. Genekspressionsmønstre hos patienter med multipel sklerose kan analyseres, eller immunfunktion og påvirkninger på det generelt 14,15,16.
PBMC’er er generelt afhængige af oxidativ phosphorylering (OXPHOS) for at generere adenosintrifosfat (ATP)17,18. Derfor dækker PBMC’er en bred vifte af applikationer som surrogater. I tidligere rapporter er PBMC’ernes energimetabolisme blevet brugt til at behandle organdysfunktioner, såsom ved tidlig hjertesvigt19, septisk chok20 eller kønsrelaterede forskelle4 i mitokondriefunktion. En generaliseret metode til kryopræservering, isolering og dyrkning af PBMC’er ville have fordele ved sammenligneligheden af resultater opnået på forskellige institutter. Der er stor variation i protokollerne for hvert trin21,22, målet med denne metode er at give en retningslinje for bioenergetiske målinger i PBMC’er.
I denne artikel beskriver vi en metode til måling af bioenergetiske parametre i PBMC’er. Vi forklarer metoderne til isolering, kryokonservering og måling af bioenergetik af PBMC’er fra humant blod. Denne metode kan bruges til at bestemme bioenergetiske parametre hos patienter og evaluere dem i en klinisk sammenhæng. For at anvende disse målinger har forskere brug for adgang til en patientpopulation, hvorfra friske blodprøver kan fås.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver mulighed for at isolere og kryobevare mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) fra humant blod på en måde, der er egnet til bioenergetiske analyser. Den beskrevne metode giver mulighed for at isolere PBMC’er forsigtigt og i store mængder med høj levedygtighed og tilstrækkelige celler til bioenergetiske målinger. Det har den ulempe, at selv med minimale afbrydelser forekommer lange isolationer, men efterfølgende kryopræservering muliggør en tidsuafhængig måling af bioenergetik. Med de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke det kliniske team på universitetshospitalet Giessen-Marburg for blodindsamlingen. Dette arbejde blev finansieret af Justus Liebig-universitetet.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologie. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
