Kryokonservierung und bioenergetische Bewertung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes
Summary
Isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes können für die Analyse von Immunfunktionen und -störungen, Stoffwechselerkrankungen oder mitochondrialen Funktionen verwendet werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine standardisierte Methode zur Herstellung von PBMCs aus Vollblut und der anschließenden Kryokonservierung. Die Kryokonservierung macht diese Zeit und diesen Ort unabhängig.
Abstract
Die physiologischen Funktionen eukaryotischer Zellen beruhen auf Energie, die hauptsächlich von den Mitochondrien bereitgestellt wird. Mitochondriale Dysfunktion ist mit Stoffwechselerkrankungen und Alterung verbunden. Die oxidative Phosphorylierung spielt dabei eine entscheidende Rolle, da sie für die Aufrechterhaltung der energetischen Homöostase entscheidend ist. PBMCs wurden als minimalinvasive Probe zur Messung der mitochondrialen Funktion identifiziert und spiegeln nachweislich Krankheitszustände wider. Die Messung der mitochondrialen bioenergetischen Funktion kann jedoch durch mehrere Faktoren in menschlichen Proben eingeschränkt sein. Einschränkungen sind die Anzahl der entnommenen Proben, die Probenahmezeit, die oft über mehrere Tage verteilt ist, und die Standorte. Die Kryokonservierung der entnommenen Proben kann eine konsistente Entnahme und Messung der Proben gewährleisten. Es sollte darauf geachtet werden, dass die gemessenen Parameter zwischen kryokonservierten und frisch präparierten Zellen vergleichbar sind. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kryokonservierung von PBMCs aus menschlichen Blutproben, um die bioenergetische Funktion der Mitochondrien in diesen Zellen zu analysieren. PBMC, die nach dem hier beschriebenen Protokoll kryokonserviert wurden, zeigen im Vergleich zu frisch geernteten Zellen nur geringfügige Unterschiede in der Zellzahl und Lebensfähigkeit, dem Adenosintriphosphatspiegel und der gemessenen Atmungskettenaktivität. Für die beschriebenen Präparate werden nur 8-24 mL menschliches Blut benötigt, wodurch es möglich ist, Proben während klinischer Studien multizentral zu entnehmen und deren Bioenergetik vor Ort zu bestimmen.
Introduction
Humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden für verschiedene Anwendungen in vielen wissenschaftlichen Bereichen verwendet, einschließlich der Untersuchung immunologischer und bioenergetischer Probleme, z. B. im Zusammenhang mit Alterungsprozessen oder degenerativen Erkrankungen 1,2. PBMCs sind heterogen aufgebaut und bestehen aus Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen), Monozyten und dendritischen Zellen. Die Zellen weisen zum Teil große individuelle Unterschiede und Variationen innerhalb eines Probanden auf, so dass standardisierte Verfahren für den Umgang mit diesen Zellen erforderlich sind. Wichtige Parameter wie Viabilität und Reinheit der Isolierung sind die Grundvoraussetzungen für ihre Handhabung und werden zusätzlich von Umweltfaktoren wie dem Zeitpunkt der Entnahme, dem Melatoninspiegel, ob der Proband nüchtern ist, und anderen beeinflusst 3,4.
Basierend auf Untersuchungen zur Bioenergetik von PBMCs beschreiben wir hier eine Methode zur Isolierung, Kryokonservierung und Kultivierung von PBMCs, die auch für andere Methoden geeignet ist. Während die Muskelbiopsie als Goldstandard für den mitochondrialen Energiestoffwechsel gilt5, ist die Untersuchung von Blutzellen ein schnelles, minimalinvasives Verfahren. Darüber hinaus deuten immer mehr Studien darauf hin, dass die Veränderungen der mitochondrialen Funktion im Alter und bei der Alzheimer-Krankheit (AD) nicht nur im Gehirn, sondern auch in der Peripherie auftreten 6,7,8,9,10. Die Methode ermöglicht auch die Untersuchung anderer Zustände und Krankheiten, einschließlich Diabetes mellitus und Adipositas 11,12,13. Genexpressionsmuster bei Multiple-Sklerose-Patienten können analysiert werden, oder die Immunfunktion und deren Einflüsse im Allgemeinen 14,15,16.
PBMCs beruhen im Allgemeinen auf oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS), um Adenosintriphosphat (ATP) zu erzeugen17,18. Daher decken PBMCs als Surrogate ein breites Anwendungsspektrum ab. In früheren Berichten wurde der Energiestoffwechsel von PBMCs verwendet, um Organdysfunktionen zu behandeln, wie z. B. bei früher Herzinsuffizienz19, septischem Schock20 oder geschlechtsassoziierten Unterschieden4 in der mitochondrialen Funktion. Eine verallgemeinerte Methode zur Kryokonservierung, Isolierung und Kultivierung von PBMCs hätte Vorteile in der Vergleichbarkeit der an verschiedenen Instituten erzielten Ergebnisse. Es gibt eine große Variation in den Protokollen für jeden Schritt21,22, das Ziel dieser Methode ist es, einen Leitfaden für bioenergetische Messungen in PBMCs bereitzustellen.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Messung bioenergetischer Parameter in PBMCs. Wir erläutern die Methoden zur Isolierung, Kryokonservierung und Messung der Bioenergetik von PBMCs aus menschlichem Blut. Mit dieser Methode können bioenergetische Parameter bei Patienten bestimmt und im klinischen Kontext ausgewertet werden. Um diese Messungen durchführen zu können, benötigen die Forscher Zugang zu einer Patientenpopulation, aus der frische Blutproben entnommen werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit zur Isolierung und Kryokonservierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus menschlichem Blut in einer Weise, die für bioenergetische Analysen geeignet ist. Die beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, PBMCs schonend und in großen Mengen zu isolieren, mit hoher Viabilität und ausreichend Zellen für bioenergetische Messungen. Sie hat den Nachteil, dass es schon bei minimalen Unterbrechungen zu langen Isolationen kommt, die anschließende Kryokonservie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns beim Klinikteam des Universitätsklinikums Gießen-Marburg für die Blutentnahme. Diese Arbeit wurde von der Justus-Liebig-Universität gefördert.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
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