Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) fungerar som en djurmodell av multipel skleros. Den här artikeln beskriver en metod för att bedöma ryggmärgsinflammation, demyelinisering och axonal skada i EAE. Dessutom presenteras en metod för att kvantifiera lösliga neurofilamentljusnivåer i musserumet, vilket underlättar bedömningen av axonal skada hos levande möss.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en vanlig immunbaserad modell av multipel skleros (MS). Denna sjukdom kan induceras hos gnagare genom aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskidan och Complete Freunds adjuvans (CFA) eller genom överföring av myelinspecifika T-effektorceller från gnagare som är primade med myelinprotein/CFA till naiva gnagare. Svårighetsgraden av EAE poängsätts vanligtvis på en 5-gradig klinisk skala som mäter graden av stigande förlamning, men denna skala är inte optimal för att bedöma omfattningen av återhämtning från EAE. Till exempel är kliniska poäng fortfarande höga i vissa EAE-modeller (t.ex. myelinoligodendrocytglykoprotein [MOG] peptidinducerad modell av EAE) trots att inflammationen har försvunnit. Det är därför viktigt att komplettera klinisk poängsättning med histologisk poängsättning av EAE, vilket också ger ett sätt att studera de bakomliggande mekanismerna för cellulär skada i centrala nervsystemet (CNS).
Här presenteras ett enkelt protokoll för att förbereda och färga ryggmärgs- och hjärnsnitt från möss och för att poängsätta inflammation, demyelinisering och axonal skada i ryggmärgen. Metoden för att skatta leukocytinfiltration i ryggmärgen kan också användas för att poängsätta hjärninflammation vid EAE. Ett protokoll för att mäta lösligt neurofilamentljus (sNF-L) i serum hos möss med hjälp av en Small Molecule Assay (SIMOA) analys beskrivs också, vilket ger återkoppling om omfattningen av den totala CNS-skadan hos levande möss.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är den vanligaste murina modellen för den mänskliga demyeliniserande sjukdomen, multipel skleros (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, inklusive infiltration av IFN-γ (gamma) och IL-17-producerande T-hjälparceller2, infiltration av inflammatoriska monocyter3, bildandet av perivaskulära och submeningeala inflammatoriska demyeliniserande lesioner4 och förekomsten av axonskada4 i centrala nervsystemet (CNS), observeras också i EAE 5,6,7,8,9. Likheten i immunmekanismer mellan EAE och MS har gjort EAE till en lämplig preklinisk modell för att testa effekt och verkningsmekanismer för ett antal godkända immunbaserade terapier för MS, inklusive natalizumab, fingolimod, dimetylfumarat och glatirameracetat (granskad i 1,5). Vissa EAE-regimer modellerar andra aspekter av progressiv MS-patologi utöver axonal skada, inklusive utveckling av submeningeal inflammation i hjärnan, kronisk demyelinisering, ryggmärgsatrofi, synaps och neuronförlust 6,10,11,12. Således har EAE nytta för att screena effekten av neuroprotektiva terapier för MS.
EAE induceras hos gnagare på ett antal sätt. Aktiv immunisering är den vanligaste induktionsmetoden och innebär immunisering av gnagare med myelinantigener (antingen hela proteiner eller peptider) emulgerade i CFA kompletterat med värmeavdödad Mycobacterium tuberculosis13. Beroende på musstammen administreras pertussistoxin (PTX) också på dag 0 och dag 2 av immuniseringen för att öka penetransen av sjukdom13. EAE kan också induceras genom adoptivöverföring av myelinspecifika T-celler erhållna från myelin/CFA-primade möss till friska möss14 eller kan utvecklas spontant i möss som överuttrycker T-cellsreceptorer som är specifika för de viktigaste myelinantigenerna5.
EAE-sjukdomens svårighetsgrad och progression poängsätts vanligtvis med hjälp av en diskret 5-gradig klinisk skala: 1 – slapp svans, 2 – svaghet i bakben eller fot, 3 – fullständig förlamning i en eller båda bakbenen, 4 – svaghet i frambenen, 5 – döende eller död13. Detta kliniska poängsystem är sunt när det gäller att dokumentera progressionen av stigande förlamning som inträffar vid sjukdomsdebut, men är mindre känsligt när det gäller att fånga omfattningen av återhämtning från CNS-inflammatoriska attacker. Till exempel tilldelas både möss som rör sig med svårighet och möss som lätt rör sig men uppvisar svaghet i fotgreppet en poäng på 2 på EAE-skalan. Poängen kan förbli höga i den postakuta fasen av EAE på grund av förekomsten av permanent axonskada eller förlust, även trots upplösningen av det inflammatoriska svaret9. Det har gjorts en mängd olika försök att utveckla mer förfinade poängsystem, beteendetester, mått på bakbens- och greppstyrka och infraröda övervakningssystem för att bättre fånga skillnader i kliniska brister i EAE 9,16,17,18; Dessa mer intrikata poängmått särskiljer dock inte bidraget från inflammation kontra vävnadsskada till de underliggande neurologiska bristerna. Således är guldstandardmetoden för att poängsätta svårighetsgraden av EAE att genomföra både klinisk och histologisk poängsättning.
Här beskrivs ett protokoll för hur man dissekerar och bäddar in ryggmärgs- och hjärnprover från mus i paraffin på ett sätt som fångar den stokastiska processen för lesionsbildning som sker vid EAE. Ett protokoll presenteras också för hur man färgar sektioner med Luxol fast blue (LFB), ursprungligen skapad av Klüver och Barrera19, som detekterar myelin i CNS. Sektionerna är antingen färgade med enbart LFB (för demyeliniseringsanalys) eller motfärgade med hematoxylin och eosin (H&E) för att hjälpa till att visualisera och poängsätta inflammatoriska lesioner. Protokoll tillhandahålls också för att kvantifiera förekomsten av totalt antal leukocyter (CD45), förlusten av myelin och antalet skadade axoner (SMI-32) i ryggmärgen med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar, immunhistokemiska (IHC) tekniker och allmänt tillgänglig programvara. Protokollet som används för att kvantifiera leukocyter i ryggmärgen kan också användas för att kvantifiera leukocyter i hjärnan.
Histologisk utvärdering av axonal förlust och skada i hjärnan är jämförelsevis svårare än i ryggmärgen eftersom hjärnans vita substans inte löper parallellt med varandra. Mätning av serumneurofilamentljus (sNF-L) har visat sig vara en lovande biomarkör för neuronal skada vid MS20,21. Nyligen genomförda studier har utökat denna teknik till EAE 22,23,24. Här presenteras en metod för att mäta serumneurofilamentljus (sNF-L) i levande möss med hjälp av en Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Denna metod kräver endast en liten mängd serum och kan göras på levande möss på bara en halv dag, vilket ger snabb återkoppling om hur en testad behandling påverkar den totala CNS-skadan. Alla metoder som beskrivs här kan tillämpas på möss av vilket kön eller stam som helst.
Histologisk färgning av ryggmärgen är ett viktigt verktyg för att bedöma svårighetsgraden av EAE-sjukdomen, särskilt i fall där det finns skillnader mellan behandlingsgrupperna i graden av sjukdomsåterhämtning i den postakuta fasen av sjukdomen. Färgning för immuncellsinfiltration (CD45), myelin (LFB) och axonal skada (SMI-32) hjälper till att karakterisera den underliggande orsaken till de förändrade kliniska poängen hos möss. Det histologiska färgningsprotokollet som beskrivs här ger ett perspektiv på inflammation samt omfattningen av myelin- och axonal skada. Dessutom validerar de visade resultaten sNF-L-mätning som en metod för att bedöma omfattningen av den totala neuronala skadan i EAE.
De kritiska parametrarna för denna analys är att säkerställa att prövarna är blinda för sektionernas identitet och att det finns likvärdig provtagning på varje nivå av ryggmärgen över de olika mössen. Detta beror på att svårighetsgraden av inflammation kan vara större vid lägre nivåer av navelsträngen. En annan kritisk parameter är storleken på experimentgrupperna. Ryggmärg och hjärna skördas vanligtvis från 6–8 möss per grupp vid endpoint för att se signifikanta skillnader mellan grupper med behandlingar eller genotyper som har blygsamma effektstorlekar. Det är också viktigt att se till att utvalda möss, när medelvärdet beräknas, har representativa medelvärden för hela gruppen. När det gäller felsökning är ett vanligt problem för dem som inte har erfarenhet av protokollet att ryggmärgen är fixerad under en otillräcklig tid och att den inte lätt kan pressas ut från ryggraden. Om så är fallet kan ryggmärgen dissekeras manuellt från kolonnen genom att klippa längs ryggradsutskotten med en fin sax och öppna kolonnen för att avslöja ryggmärgen. Alternativt kan vävnader fixeras i ytterligare några dagar utan att störa framgången med antikroppsfärgning. De antikroppskloner som beskrivs här verkar i vävnad fixerad upp till 2 veckor i formalin.
Att bädda in ryggmärgsbitarna kräver skicklighet och övning. Det rekommenderas att ögonluppar bärs och att en lampa riktas över inbäddningsstationen för att bättre visualisera om sektionerna faller i tvärsnitt eller i längsgående sektion. Att hålla ryggmärgsbitarnas längd på mindre än 2 mm under grovning hjälper dem att falla i tvärsnitt. Ett annat vanligt problem som uppstår för mindre erfarna användare är att LFB avdunstar under inkubationen över natten, vilket gör att hälften av objektglaset är fläckigt och hälften ofärgat. För att undvika avdunstning bör glasfärgningsskålen förseglas med termoplastfilm och sedan plastfolie. Om avdunstning sker och sektionerna är ojämnt färgade, rekommenderas det att helt avblå glasen med litiumkarbonat och färga om dem i LFB över natten. Ett annat vanligt problem är att användarna inte helt avblåar den grå substansen efter LFB. Det är viktigt att undersöka enskilda sektioner under mikroskopet för att säkerställa att en tillräcklig mängd avblåning har uppnåtts innan du fortsätter med andra steg i protokollet. Dessutom, även om CD45- och SMI-32 IHC-färgerna presterar robust, är det fortfarande viktigt att felsöka antikroppskoncentrationer i preliminära experiment för varje nytt antikroppsparti som tas emot. Detta kan göras genom att testa en mängd olika koncentrationer av antikroppen på en positiv kontrollsektion (EAE ryggmärg). Förstagångsfärgning bör också inkludera en negativ kontroll som består av enbart sekundär antikropp utan tillsatt primär antikropp. Slutligen är det viktigt i bildanalysen att tröskelra enskilda bilder eftersom färgningen kan vara ojämn över bilder eller sektioner.
Detta protokoll använder fritt tillgänglig programvara. Om man inte har tillgång till en processor, en inbäddare eller mikrotom kan dessa steg hämtas till en sjukhusbaserad patologikärna som erbjuder dessa tjänster. Dessutom, om man inte har tillgång till en diabildsskanner, kan man använda ett ljusmikroskop som är utrustat med en videokamera för att spara TIFF-bilder av ryggmärgen eller hjärnregionerna. För ett mikroskopbaserat arbetsflöde, fånga LFB- eller LFB/H&E-sektioner vid låg effekt (40x förstoring) och för CD45- och SMI-32-färgning, avbilda minst fyra fönster som är centrerade i de ventrala, dorsala och laterala delarna av ryggmärgen (200x förstoring för CD45 och 400x förstoring för SMI-32). Bildanalys kan utföras på dessa bilder för att kvantifiera färgning på ett liknande sätt som beskrivs.
Beslutet om vilket histologiskt tillvägagångssätt som ska användas för att poängsätta EAE beror på hur mycket de kliniska poängen skiljer sig åt mellan grupperna. Till exempel, om det finns drastiska skillnader i EAE:s kliniska poäng (en grupp fick EAE och en inte), relaterar detta vanligtvis till skillnader i perifert medierad inflammation. I det här fallet räcker det med att poängsätta för förekomsten av demyeliniserande lesioner på LFB/H&E-färgade sektioner och kommer att avslöja skillnader mellan grupperna. Om grupperna är mer likartade i klinisk poäng vid debut och det istället finns skillnader i omfattningen av klinisk återhämtning (t.ex. experimentet i figur 5A), är det bäst att tillämpa hela det histologiska arbetsflödet som beskrivs här, inklusive poängsättning av hjärninflammation i hjärnstammen och lillhjärnan, för att särskilja om skillnaderna i sjukdomens kronicitet relaterar till skillnader i inflammation eller vävnadsskada. Om skillnader i inflammation upptäcks, bedömda genom CD45-räkning, kan ytterligare IHC-studier göras för att färga för T-celler (anti-CD3), infiltrerande monocyter/makrofager (Mac3) och mikroglia (Iba-1/TMEM119) (rekommenderade antikroppskloner finns i tilläggstabell 3). Mikrogliaaktiveringen återspeglas av en ökning av intensiteten av Iba-1-färgning på dubbelmärkta Iba-1+TMEM-19+ mikroglia och en ökad retraktion av mikrogliaprocesser som kan bedömas genom Sholl-analys på avsnitt32. Dessutom kan tekniker som flödescytometri eller encells-RNA-sekvensering tillämpas för att genomföra en djupare karakterisering av frekvensen och fenotypen av immunpopulationer i hjärnan och ryggmärgen.
Räkningen av SMI-32+ axoner är en känslig metod för att detektera axonskador i EAE32,33 och i MS34. SMI-32, som detekterar den icke-fosforylerade formen av neurofilament tungt eller medium, ackumuleras i ändbulber av transekterade neuroner. Ett alternativ för att upptäcka skadade axoner är att färga med amyloidprekursorprotein (APP) som kan ansamlas i axoner till följd av störd axontransport33. Färgningsmönstret för SMI-32 och APP, även om båda båda återspeglar axonskada, överlappar vanligtvis inte, vilket tyder på att de upptäcker olika patologier33. Man kan också komplettera histologiska mått på axonskada genom att mäta sNF-L, som är ett snabbt och känsligt mått på pågående axonal skada i både ryggmärgen och hjärnan. Det har fördelen att det kan göras på en halv dag i levande möss. En nackdel med denna metod är att satserna är dyra och maskinen är mycket specialiserad. Företaget som säljer sNF-L-kitet erbjuder en avgift för service för dem som inte har tillgång till en SIMOA-maskin. Ett alternativ till att bedöma axonskada är att poängsätta axonförlust genom att antingen räkna axoner i toluidinblåfärgade delar av ryggmärgen12 eller räkna neurofilamentbuntar detekterade av SMI-31 i områden av ryggmärgens vita substans32. Båda dessa är mer mödosamma metoder än SMI-32 eller sNF-L-mätning.
Om EAE:s kliniska poäng skiljer sig åt mellan grupperna, men skattning för inflammation, demyelinisering och axonal skada inte avslöjar skillnader mellan grupperna, kan det vara användbart att färga för astrocytaktivering med GFAP (se tilläggstabell 3 för rekommenderad antikroppsklon). Aktivering av astrocyter är förknippad med en ökning av GFAP-färgning och detta har visat sig korrelera med EAE-progression i vissa EAE-modeller, inklusive kronisk EAE hos DA-råttan35.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll metoder och tillhandahåller ett analysarbetsflöde för att utföra histologisk poängsättning av EAE.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Raymond Sobel (Stanford University) för att han visade oss sin metod för att grovhugga och fixa hjärn- och ryggmärgssnitt. Vi tackar Kyle Roberton och Milan Ganguly från Toronto Centre for Phenogenomics för att de lärt sig inbäddningsmetoden och för att ha skurit av så många av våra hjärn- och ryggmärgssektioner. Vi tackar Dr. Matthew Cussick och Dr. Robert Fujinami (University of Utah) för att de delar med sig av sina protokoll för att bedöma submeningeal och perivaskulär inflammation i ryggmärgen. Vi tackar Shalina Ousman för att hon delade med sig av klonen av CD45-antikroppen. Vi tackar Xiofang Lu för utbildning på vävnadsprocessorn och vävnadsinbäddningsstationen och för underhållet av denna utrustning vid Keenan Research Centre of Biomedical Research vid St. Michael’s Hospital. Detta arbete stöddes av ett biomedicinskt anslag från MS Canada (till SED). Carmen Ucciferri stöds av en studenttjänst från Kanadas regering. Nuria Alvarez-Sanchez stöds av ett Keenan postdoktoralt stipendium.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |