遺伝子改変マウスモデルにおける悪性末梢神経鞘腫瘍の同定、診断、および悪性度判定
Summary
私たちは、遺伝子改変マウスの神経系新生物がヒトの病理を正確に再現しているかどうかを評価するための方法論を開発しました。本研究では、これらの組織学的手法、定義された病理学的基準、および培養方法論を、P 0-GGFβ3マウスモデルで発生する神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍に適用します。
Abstract
常染色体優性腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者は、一般的に叢状神経線維腫(PN)を発症し、その後、非常に侵攻性の高い悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化します。PNがMPNSTに変化するプロセスを理解することは、NF1のヒトで見られるPN-MPNSTの進行を正確に再現する遺伝子改変マウス(GEM)モデルの利用可能性によって容易になります。残念ながら、Nf1アブレーションを用いたGEMモデルでは、このプロセスを完全に再現することはできません。そこで、シュワン細胞でシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)を過剰発現させることでPNを発現させ、高頻度でMPNSTに進行するGEMモデルであるP 0-GGFβ3マウスを開発しました。しかし、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成と腫瘍性進行がNF1患者に見られるプロセスを正確にモデル化しているかどうかを判断するには、まず、P0-GGFβ3末梢神経鞘腫瘍の病理がヒトの病理を再現していることを証明する必要がありました。
ここでは、P 0-GGFβ3およびP0-GGFβ3を使用して、GEMモデルで末梢神経系新生物を正確に診断および等級付けするために使用される特殊な方法論について説明します。例としてTrp53+/-マウス。PNおよびMPNSTの診断に使用される組織学的、免疫組織化学的、および組織化学的方法、これらの新生物をそれらの病理学を模倣する他の腫瘍型と区別する方法、およびこれらの新生物を等級付けする方法について説明します。本稿では、GEM MPNSTからの早期継代培養の確立、免疫細胞化学を用いたこれらの培養物の特性評価方法、および同種移植片の確立による腫瘍原性の検証方法について議論する。総じて、これらの技術は、GEMモデルで発生するPNおよびMPNSの病理を特徴付け、これらのマウス腫瘍の病理をヒトの病理学と批判的に比較します。
Introduction
過去30年間にわたり、多くの研究室が、ヒトのがん関連変異をマウスゲノムに導入したり、ヒトのがんに過剰発現している遺伝子産物を過剰発現させたりすることで、ヒトがんのマウスモデルの作成を試みてきました。得られた遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、新たに導入されたゲノム改変が腫瘍形成を開始することの確立、腫瘍の進行に寄与する他のその後に発生する遺伝的またはエピジェネティックな変化の同定、腫瘍の開始と進行を促進する主要なシグナル伝達経路の定義など、さまざまな目的に使用できます。免疫不全マウスの使用に依存する同所異種移植モデルとは異なり、GEMがんモデルは完全に機能する免疫系を持っているため、候補となる治療薬に対する反応をより正確にモデル化できます。しかし、このような目的でGEMがんモデルを使用する場合、研究者はGEM新生物で行われた観察がヒトの対応物に関連していることを確認することが不可欠です。この検証には、GEM新生物の病理学の徹底的な評価と、GEM新生物の病理学的特徴が対応するヒト腫瘍型の病理学を再現しているかどうかの決定を含める必要があります。
腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)は、人間の神経系に影響を与える最も一般的な遺伝性疾患であり、3,000〜3,500人の出生ごとに約1人で発生します1,2,3。NF1に罹患した個人は、皮膚(皮膚神経線維腫)および大きな神経および神経叢(網状神経線維腫)に神経線維腫として知られる複数の良性末梢神経鞘腫瘍を発症します。皮膚神経線維腫と叢状神経線維腫はどちらも身体的、行動的、および/または社会的障害を引き起こすことにより患者の生活の質を悪化させますが、叢状神経線維腫(PN)は特に危険です4,5。これは、PNが悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)に変化することが多いためであり、これは生存率が非常に低い侵攻性の紡錘細胞腫瘍である1,2。この生存率の低さは、MPNSTの治療に現在使用されている放射線療法および化学療法レジメンが効果がないことが主な原因です。しかし、より効果的な新しい治療法の開発は困難でした。これは、MPNSTがNF1患者にどれほど一般的に発生するかにもかかわらず、MPNSTは依然としてまれな新生物であるためです。その結果、研究のために多数のヒト腫瘍を入手することは非常に困難です。また、臨床試験のために十分な数のMPNST患者を募集することも困難です。これらの限界を克服するために、神経線維腫の病因とPN-MPNSTの進行を促進する異常に関するさらなる洞察を得て、候補となる治療薬の前臨床試験を促進することを目的として、いくつかのGEMモデルが作成されました。
NF1患者は、NF1遺伝子の1つのコピーに不活性化変異を有する。神経線維腫の病因は、シュワン細胞系統の細胞に残りの機能的NF1遺伝子の不活性化変異が発生したときに引き起こされます。しかし、驚くべきことに、生殖細胞不活性化Nf1変異を持つマウスを作製したところ、神経線維腫は発症しなかった6,7。その後の実証では、Nf1-nullシュワン細胞と他のすべての細胞型におけるNf1ハプロ不全を有するマウス(Krox20-Cre;Nf1flox/-マウス)は、神経線維腫の病因には、他の細胞型におけるNf1遺伝子の投与量の減少が必要であることを示唆している8。それでも、Krox20-Creの叢状神経線維腫;Nf1flox/-マウスはMPNSTに進化しなかったため、ヒトの生態を部分的に模倣したに過ぎない。MPNSTの病因は、Nf1変異がTrp539やCdkn2a10などの追加の腫瘍抑制遺伝子の変異と組み合わされたときに起こったが、これらのGEMモデルにおけるMPNSTは、既存の良性叢状神経線維腫からではなく、de novoまたは生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBP)から発症した11,12(13,14参照)これらのモデルや、Suz12やPten15などの遺伝子にMPNST関連の機能喪失変異を追加導入した他のモデルの優れたレビュー。
これらのマウスモデルは、NF1、TP53、CDKN2Aなどの遺伝子がNF1関連末梢神経系新生物の病因に果たす役割を確立し、治療薬候補を試験する前臨床試験に非常に貴重です。しかし、叢状神経線維腫が進行して、生物学的可能性が不確かな非定型神経線維腫性腫瘍(ANNUBPs16)になり、次にMPNSTになるプロセスについては、まだ完全には理解されていません。最近では、Nf1とArfに欠失したマウスがANNUBPを発達させ、それがMPNSTに進行するという報告があり、このプロセスの理解が進んでいます11。しかし、ヒトに見られる網状神経線維腫-MPNSTの進行過程を完全に再現したNf1変異ベースのマウスモデルはまだ存在しません。さらに、MPNSTの発症につながる複数の異なる経路があるかどうかは明らかではありません。このことを考えると、上記のGEMは、神経線維腫-MPNSTの進行およびMPNSTの病因につながるいくつかの異なる経路のサブセットのみをモデル化している可能性があります。この点は、MPNSTも散発的に発生し、一部の散発的なMPNSTは明らかにNF1変異を有さないという事実によって強調されている17,18。
この後者の点は、 NF1 変異を欠く少なくともいくつかの散発性MPNSTが黒色腫または別のタイプの肉腫であるというMagollon-Lorenzらの最近の提案によって異議を唱えられてきましたが19、私たちは最近、散発性MPNSTと、この腫瘍に由来する細胞株(2XSB細胞)が NF1 野生型であることを報告しました20.親腫瘍および2XSB細胞株の特性評価において、散発性悪性末梢神経鞘腫瘍の鑑別診断で日常的に考慮される黒色腫および他の複数の肉腫型を含む代替診断の可能性を系統的に除外した20。さらに、Magollon-Lorenzらは、彼らが研究した3つの散発性MPNST細胞株における彼らの知見は、散発性MPNSTとして同定されたすべての腫瘍がMPNSTではないことを示すために一般化できないことを認めたことに留意する。
神経線維腫とMPNSTの病因が必ずしも特定の腫瘍抑制遺伝子変異に依存しないGEMモデルを構築するために、強力なシュワン細胞マイトジェンニューレグリン-1(NRG1)の過剰発現がシュワン細胞特異的ミエリンタンパク質ゼロ(P0)プロモーター(P 0-GGFβ3マウス)によって駆動されたトランスジェニックマウスを作製した21.我々は以前に、ヒト神経線維腫、MPNST、およびMPNST細胞株が、NRG1シグナル伝達を媒介するerbB受容体チロシンキナーゼ(erbB2、erbB3、およびerbB4)とともにいくつかのNRG1アイソフォームを発現し、これらのerbB受容体が恒常的に活性化されることを示しました22。また、erbBキナーゼの薬理学的阻害剤がMPNSTの増殖22、生存23、遊走24を強力に阻害することも実証した。ヒトでの観察結果と同様に、P 0-GGFβ3マウスは叢状神経線維腫を発症し25、高頻度でMPNSTに進行する21,25。我々は、P 0-GGFβ3 MPNST、ヒトのMPNST、Trp53およびCdkn2aの変異、および腫瘍形成に寄与する可能性のある他の多くのゲノム異常を一般的に発症することを示しました25。P 0-GGFβ3マウスに生じるMPNSTは、不活性化Nf1変異を有しない。しかし、遺伝的相補性を用いて、NRG1は、主にNf1の欠損によって変化したのと同じシグナル伝達カスケードを介して、P 0-GGFβ3マウスの腫瘍形成を促進することを示した26。この結論は、Trp53ハプロ不全(P 0-GGFβ3;Trp53+/-マウス)は、シス-Nf1+/-に見られるように、MPNSTがde novoを発症する動物を産生する。Trp53+/-マウス27。
P 0-GGFβ3マウスがNF1のヒトに見られる神経線維腫の病因および神経線維腫-MPNST進行のプロセスを正確にモデル化することを実証するこの情報およびその他の情報を得るために、これらの動物の組織を処理し、それらの腫瘍を正確に診断し、これらのマウスで発生するMPNSTを等級付けし、早期継代P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3を確立して特徴付けるための専門的な方法論を開発しました。Trp53+/- MPNST培養、およびP 0-GGFβ3 PNおよびMPNST、およびP0-GGFβ3の病理学を批判的に比較する。Trp53+/- MPNSTをヒトのMPNSTと比較します。これらの方法論の多くは、神経系腫瘍の他のGEMモデルに一般化可能である。さらに、これらの方法論のいくつかは、新生物が他の臓器部位に発生するGEMモデルにより広く適用できます。したがって、ここではこれらの方法論の詳細な説明を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する組織学的および生化学的方法は、神経線維腫およびMPNSTの病因のGEMモデルを診断および特徴付けるためのフレームワークを提供します。何年にもわたって、これらの方法論は、GEMモデルで発生する末梢神経鞘腫瘍の病理を評価するのに非常に有用であることがわかりました21、25、26。しかしながら、ここで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353およびR01 NS109655 to S.L.C.;R01 NS109655-03S1 から D.P.J.)、国立がん研究所 (R01 CA122804 から S.L.C.)、および国防総省 (X81XWH-09-1-0086 および W81XWH-12-1-0164 から S.L.C. へ)。
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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