Identifisere, diagnostisere og gradere ondartede perifere nerveskjede svulster i genetisk utviklede musemodeller

Summary

Vi har utviklet en metodikk for å vurdere om nervesystemet neoplasmer i genetisk utviklede mus nøyaktig rekapitulerer patologien til deres menneskelige kolleger. Her bruker vi disse histologiske teknikkene, definerte patologiske kriterier og kulturmetoder på nevrofibromer og ondartede perifere nerveskjede svulster som oppstår i P 0-GGFβ3 musemodellen.

Abstract

Pasienter med autosomal dominant tumor følsomhetssyndrom nevrofibromatose type 1 (NF1) ofte utvikle pleksiforme nevrofibromer (PN) som senere transformere til svært aggressive ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNSTs). Å forstå prosessen der en PN forvandles til en MPNST vil bli lettere av tilgjengeligheten av genetisk utviklede musmodeller (GEM) som nøyaktig replikerer PN-MPNST-progresjonen sett hos mennesker med NF1. Dessverre rekapitulerer ikke GEM-modeller med Nf1-ablasjon denne prosessen fullt ut. Dette førte til at vi utviklet P 0-GGFβ3 mus, en GEM-modell der overekspresjon av Schwann-cellens mitogennevrenegulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterer i utvikling av PNer som utvikler seg til å bli MPNST med høy frekvens. For å avgjøre om tumorigenese og neoplastisk progresjon i P 0-GGFβ3-mus nøyaktig modellerer prosessene sett hos NF1-pasienter, måtte vi imidlertid først bevise at patologien til P_0-GGFβ3 perifere nerveskjede svulster rekapitulerer patologien til deres menneskelige kolleger.

Her beskriver vi de spesialiserte metodene som brukes til nøyaktig å diagnostisere og gradere perifere nervesystemsvulster i GEM-modeller, ved bruk av P 0-GGFβ3 og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- mus som eksempel. Vi beskriver de histologiske, immunhistokjemiske og histokjemiske metodene som brukes til å diagnostisere PN og MPNST, hvordan man skiller disse neoplasmene fra andre tumortyper som etterligner deres patologi, og hvordan man graderer disse neoplasmene. Vi diskuterer etablering av kulturer i tidlig passasje fra GEM MPNST, hvordan disse kulturene kan karakteriseres ved hjelp av immuncytokjemi, og hvordan tumorgenisiteten kan verifiseres ved å etablere allotransplantater. Samlet karakteriserer disse teknikkene patologien til PN og MPNST som oppstår i GEM-modeller og sammenligner kritisk patologien til disse murintumorene med deres menneskelige kolleger.

Introduction

I løpet av de siste tre tiårene har mange laboratorier forsøkt å lage musemodeller av menneskelige kreftformer ved å introdusere humane kreftassosierte mutasjoner i musegenomet eller ved å overuttrykke et genprodukt som er overuttrykt i humane kreftformer. De resulterende genetisk utviklede musmodellene (GEM) kan brukes til en rekke formål, for eksempel å fastslå at den nylig introduserte genomiske modifikasjonen initierer tumorigenese, identifiserer andre senere forekommende genetiske eller epigenetiske endringer som bidrar til tumorprogresjon, og definerer de viktigste signalveiene som driver tumorinitiering og progresjon. I motsetning til ortotopiske xenograftmodeller, som er avhengige av bruk av immundefekte mus, har GEM-kreftmodeller et fullt funksjonelt immunsystem og modellerer derfor mer nøyaktig responser på kandidatterapeutiske midler. Men når du bruker GEM-kreftmodeller til formål som disse, er det viktig at etterforskere bekrefter at observasjoner gjort med GEM-neoplasmer er relevante for deres menneskelige kolleger. Denne valideringen bør omfatte en grundig vurdering av patologien til GEM-neoplasmene og en bestemmelse om hvorvidt de patologiske egenskapene til GEM-neoplasmene rekapitulerer patologien til den tilsvarende humane tumortypen.

Tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1) er den vanligste genetiske sykdommen som påvirker det menneskelige nervesystemet, og forekommer hos omtrent 1 av hver 3.000-3.500 levendefødte ^1,2,3. Personer plaget med NF1 utvikle flere godartede perifere nerveskjede svulster kjent som nevrofibromer i huden (dermal nevrofibromer) og i store nerver og nerve plexuses (plexiform nevrofibromer). Mens både dermal og plexiform nevrofibromer forverre pasientens livskvalitet ved å produsere fysisk, atferdsmessig, og / eller sosial svekkelse, plexiform nevrofibromer (PN) er spesielt farlig ^4,5. Dette skyldes at PNs ofte transformerer til ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST), som er aggressive spindelcelleneoplasmer med en eksepsjonelt lav overlevelse ^1,2. I stor grad skyldes denne lave overlevelsesraten at radio- og kjemoterapeutiske regimer som for tiden brukes til å behandle MPNST, er ineffektive. Det har imidlertid vært utfordrende å utvikle nye og mer effektive behandlingsformer. Dette er fordi, til tross for hvor ofte MPNST forekommer hos NF1-pasienter, er de fortsatt sjeldne neoplasmer. Som et resultat er det svært vanskelig å skaffe et stort antall humane svulster for studier; Det er også utfordrende å rekruttere nok pasienter med MPNST til kliniske studier. For å overvinne disse begrensningene har flere GEM-modeller blitt generert med sikte på å få ytterligere innsikt i abnormitetene som driver patogenese av nevrofibrom og PN-MPNST-progresjon og for å lette prekliniske studier med kandidatterapeutiske midler.

NF1-pasienter har inaktiverende mutasjoner i en kopi av NF1-genet. Nevrofibroma patogenese utløses når en inaktiverende mutasjon i det gjenværende funksjonelle NF1-genet forekommer i en celle i Schwann-cellelinjen. Overraskende, men når mus ble generert med germline inaktiverende Nf1 mutasjoner, utviklet de ikke nevrofibromer ^6,7. Den påfølgende demonstrasjonen av at mus med Nf1-null Schwann-celler og Nf1 haploinsuffisiens i alle andre celletyper (Krox20-Cre;Nf1^{flox / –} mus) utviklet pleksiforme nevrofibromer antydet at redusert Nf1 gendosering i flere celletyper var nødvendig for nevrofibroma patogenese⁸. Selv da, de pleksiforme nevrofibromer i Krox20-Cre; Nf1^{flox / –} mus utviklet seg ikke til å bli MPNSTs og så bare delvis etterlignet biologien til sine menneskelige kolleger. MPNST-patogenesen oppsto når Nf1-mutasjoner ble assosiert med mutasjoner i ytterligere tumorsuppressorgener som Trp53⁹ eller Cdkn2a¹⁰, men MPNST i disse GEM-modellene utviklet de novo eller fra atypiske nevrofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potensial (ANNUBPs)^11,12, snarere enn fra allerede eksisterende benigne pleksiforme nevrofibromer (se^13,14 for gode vurderinger av disse modellene, samt andre modeller som introduserer ytterligere MPNST-assosiert tap av funksjonsmutasjoner i gener som Suz12 og Pten¹⁵).

Disse musemodellene har vært uvurderlige for å etablere rollen som gener som NF1, TP53 og CDKN2A spiller i patogenesen av NF1-assosierte perifere nervesystemsvulster og for prekliniske studier som tester kandidatterapeutiske midler. Imidlertid har vi fortsatt en ufullstendig forståelse av prosessen der pleksiforme nevrofibromer utvikler seg til å bli atypiske nevrofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potensial (ANNUBPs¹⁶) og deretter MPNSTs. Noe fremgang har nylig blitt gjort i å forstå denne prosessen med den nylige rapporten om at mus med slettinger i Nf1 og Arf utvikler ANNUBPs som utvikler seg til å bli MPNSTs¹¹. Imidlertid eksisterer ikke Nf1-mutasjonsbaserte musemodeller som fullstendig rekapitulerer prosessen med pleksiform nevrofibrom-MPNST-progresjon sett hos mennesker. I tillegg er det ikke klart om det er flere forskjellige veier som fører til utviklingen av MPNST. Gitt dette er det mulig at GEMene beskrevet ovenfor bare modellerer en delmengde av flere forskjellige veier som fører til nevrofibrom-MPNST-progresjon og MPNST-patogenese. Dette poenget understrekes av det faktum at MPNST også forekommer sporadisk og at noen sporadiske MPNSTer tilsynelatende ikke har NF1-mutasjoner ^17,18.

Selv om dette siste punktet har blitt utfordret av Magollon-Lorenz et al. ‘s siste forslag om at minst noen sporadiske MPNSTs mangler NF1 mutasjoner er melanomer eller en annen type sarkom¹⁹, har vi nylig rapportert en sporadisk MPNST og en cellelinje avledet fra denne svulsten (2XSB celler) som var NF1 villtype²⁰. Under karakteriseringen av modertumor og 2XSB-cellelinjen utelukket vi systematisk alternative diagnostiske muligheter, inkludert melanom og de mange andre sarkomtypene som rutinemessig vurderes i differensialdiagnosen av en sporadisk ondartet perifer nerveskjede^{svulst 20}. I tillegg bemerker vi at Magollon-Lorenz et al. erkjente at deres funn i de tre sporadiske MPNST-cellelinjene som de studerte, ikke kunne generaliseres for å indikere at alle svulster identifisert som sporadiske MPNST ikke er MPNST.

For å konstruere en GEM-modell der nevrofibrom og MPNST-patogenese ikke nødvendigvis var avhengig av spesifikke tumorsuppressorgenmutasjoner, genererte vi transgene mus der overekspresjon av den potente Schwann-cellen mitogen neuregulin-1 (NRG1) ble drevet av Schwann-cellespesifikt myelinprotein null (P₀) promotor (P 0-GGFβ3 mus)²¹. Vi har tidligere vist at humane nevrofibromer, MPNST og MPNST-cellelinjer uttrykker flere NRG1-isoformer sammen med erbB-reseptortyrosinkinasene (erbB2, erbB3 og erbB4) som medierer NRG1-signalering og at disse erbB-reseptorene er konstitutivt aktivert²². Vi har også vist at farmakologiske hemmere av erbB-kinasene kraftig hemmer MPNST-proliferasjon²², overlevelse²³ og migrasjon²⁴. I tråd med våre observasjoner hos mennesker utvikler P 0-GGFβ3-mus pleksiforme nevrofibromer²⁵ som utvikler seg til å bli MPNST med høy frekvens ^21,25. Vi har vist at P 0-GGFβ3 MPNSTs, som deres menneskelige kolleger, ofte utvikler mutasjoner av Trp53 og Cdkn2a, samt mange andre genomiske abnormiteter som potensielt bidrar til tumorigenesis²⁵. MPNST som oppstår i P 0-GGFβ3-mus har ikke inaktiverende Nf1-mutasjoner. Ved hjelp av genetisk komplement viste vi imidlertid at NRG1 fremmer tumorigenese hos P 0-GGFβ3-mus hovedsakelig gjennom de samme signalkaskader som endres av Nf1-tap ²⁶; denne konklusjonen er basert på vårt funn om at erstatning av NRG1-overuttrykk for Nf1-tap i nærvær av Trp53-haploinsuffisiens (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- mus) produserer dyr der MPNST utvikler de novo, som man ser i cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- mus²⁷.

For å få denne og annen informasjon som viser at P 0-GGFβ3-mus nøyaktig modellerer prosessene for nevrofibromapatogenese og nevrofibrom-MPNST-progresjon sett hos mennesker med NF1, har vi utviklet spesialiserte metoder for behandling av vev fra disse dyrene, nøyaktig diagnostisering av svulstene deres, gradering av MPNST-ene som oppstår i disse musene, etablering og karakterisering av tidlig passasje P_0-GGFβ3 og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST-kulturer og kritisk sammenligning av patologien til P 0-GGFβ3 PN og MPNST og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNSTs til sine menneskelige kolleger. Mange av disse metodene er generaliserbare til andre GEM-modeller av nervesystemet neoplasi. I tillegg er flere av disse metodene mer bredt anvendelige for GEM-modeller der neoplasmer oppstår på andre organsteder. Derfor presenterer vi her en detaljert beskrivelse av disse metodene.

Protocol

Prosedyrene beskrevet her ble godkjent av Medical University of South Carolina IACUC og ble utført av riktig opplært personell i samsvar med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs retningslinjer for institusjonell dyrepleie. 1. Bestemme tumorpenetrans og overlevelse i P 0-GGFβ3 mus og identifisere svulster i disse dyrene for videre karakterisering Generer kohorten av mus som vil bli vurdert for tumorigenese. Antall mus som kreves, avh…

Representative Results

Figur 2 illustrerer eksempler på grovt tydelige svulster som oppstår i P 0-GGFβ3-mus. Svulster som er lett identifiserbare med det blotte øye, kan ses som masser som strekker seg mot kroppsregioner som vist i figur 2A (pil). Ved avgjørelse av om neoplasma er potensielt en perifer nerveskjede svulst, er det viktig å fastslå at svulsten er assosiert med en perifer nerve. I dette tilfellet viser en MR-undersøkelse (figur 2B</…

Discussion

De histologiske og biokjemiske metodene som presenteres her, gir et rammeverk for diagnostisering og karakterisering av GEM-modeller av nevrofibrom og MPNST-patogenese. Gjennom årene har vi funnet disse metodene å være ganske nyttige for å vurdere patologien til perifere nerveskjede svulster som oppstår i GEM-modeller 21,25,26. Imidlertid, mens protokollene som er skissert her, er nyttige for å bestemme hvor nøyaktig svul…

Materials

100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31