Identificação, diagnóstico e classificação de tumores malignos da bainha do nervo periférico em modelos de camundongos geneticamente modificados
Summary
Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.
Abstract
Pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral autossômica dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1) comumente desenvolvem neurofibromas plexiformes (NPs) que posteriormente se transformam em tumores malignos altamente agressivos da bainha do nervo periférico (MPNSTs). A compreensão do processo pelo qual um PN se transforma em um MPNST seria facilitada pela disponibilidade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) que replicam com precisão a progressão PN-MPNST observada em humanos com NF1. Infelizmente, os modelos de GEM com ablação de Nf1 não recapitulam totalmente esse processo. Isso nos levou a desenvolver camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de GEM no qual a superexpressão da neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) em células de Schwann resulta no desenvolvimento de PNs que progridem para se tornarem MPNSTs com alta frequência. No entanto, para determinar se a tumorigênese e a progressão neoplásica em camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos observados em pacientes com NF1, tivemos que primeiro provar que a patologia dos tumores da bainha do nervo periférico P0-GGFβ3 recapitula a patologia de seus homólogos humanos.
Aqui, descrevemos as metodologias especializadas usadas para diagnosticar e graduar com precisão neoplasias do sistema nervoso periférico em modelos de GEM, usando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Ratos Trp53+/- como exemplo. Descrevemos os métodos histológicos, imuno-histoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NPs e MPNSTs, como distinguir essas neoplasias de outros tipos de tumores que mimetizam sua patologia e como graduar essas neoplasias. Discutimos o estabelecimento de culturas de passagem precoce a partir de MPNSTs GEM, como caracterizar essas culturas por imunocitoquímica e como verificar sua tumorigenicidade através do estabelecimento de aloenxertos. Coletivamente, essas técnicas caracterizam a patologia de NPs e MPNSTs que surgem em modelos de GEM e comparam criticamente a patologia desses tumores murinos com seus homólogos humanos.
Introduction
Nas últimas três décadas, vários laboratórios tentaram criar modelos de camundongos de cânceres humanos introduzindo mutações associadas ao câncer humano no genoma de camundongos ou superexpressando um produto genético que é superexpresso em cânceres humanos. Os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) resultantes podem ser usados para uma variedade de propósitos, como estabelecer que a modificação genômica recém-introduzida inicia a tumorigênese, identificar outras alterações genéticas ou epigenéticas que ocorrem subsequentemente que contribuem para a progressão do tumor e definir as principais vias de sinalização que impulsionam a iniciação e a progressão do tumor. Ao contrário dos modelos de xenoenxerto ortotópico, que dependem do uso de camundongos imunodeficientes, os modelos de câncer GEM têm um sistema imunológico totalmente funcional e, portanto, modelam com mais precisão as respostas aos agentes terapêuticos candidatos. No entanto, ao usar modelos de câncer de GEM para fins como esses, é essencial que os investigadores confirmem que as observações feitas com neoplasias de GEM são relevantes para seus homólogos humanos. Essa validação deve incluir uma avaliação completa da patologia das neoplasias do GEM e determinar se as características patológicas das neoplasias do GEM recapitulam a patologia do tipo de tumor humano correspondente.
A síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1) é a doença genética mais comum que acomete o sistema nervoso humano, ocorrendo em aproximadamente 1 em cada 3.000-3.500 nascidos vivos1,2,3. Indivíduos acometidos por NF1 desenvolvem múltiplos tumores benignos da bainha dos nervos periféricos, conhecidos como neurofibromas, na pele (neurofibromas dérmicos) e em grandes nervos e plexos nervosos (neurofibromas plexiformes). Enquanto os neurofibromas dérmicos e plexiformes pioram a qualidade de vida do paciente por produzirem prejuízo físico, comportamental e/ou social, os neurofibromas plexiformes (NPs) são particularmente perigosos 4,5. Isso ocorre porque os RNPT frequentemente se transformam em tumores malignos da bainha do nervo periférico (MPNSTs), que são neoplasias agressivas de células fusiformes com sobrevida excepcionalmentebaixa1,2. Em grande parte, essa baixa sobrevida deve-se à ineficácia dos regimes radioterápicos e quimioterápicos atualmente utilizados para o tratamento dos MPNSTs. No entanto, o desenvolvimento de novas terapias mais eficazes tem sido um desafio. Isso porque, apesar da frequência com que as MPNSTs ocorrem em pacientes com NF1, ainda são neoplasias raras. Como resultado, é muito difícil obter um grande número de tumores humanos para estudo; também é um desafio recrutar pacientes suficientes com MPNSTs para ensaios clínicos. Para superar essas limitações, vários modelos de GEM foram gerados com o objetivo de obter mais informações sobre as anormalidades que conduzem a patogênese do neurofibroma e a progressão do PN-MPNST e facilitar ensaios pré-clínicos com candidatos a agentes terapêuticos.
Pacientes com NF1 apresentam mutações inativadoras em uma cópia do gene NF1. A patogênese do neurofibroma é desencadeada quando uma mutação inativadora no gene NF1 funcional remanescente ocorre em uma célula da linhagem celular de Schwann. Surpreendentemente, no entanto, quando camundongos foram gerados com mutações Nf1 inativadoras da linhagem germinativa, eles não desenvolveram neurofibromas 6,7. A demonstração subsequente de que camundongos com células de Schwann Nf1-nulas e haploinsuficiência Nf1 em todos os outros tipos celulares (Krox20-Cre;Nf1flox/- camundongos) desenvolveram neurofibromas plexiformes sugerindo que a dosagem reduzida do gene Nf1 em tipos celulares adicionais era necessária para a patogênese do neurofibroma8. Mesmo assim, os neurofibromas plexiformes em Krox20-Cre; Nf1flox/- camundongos não progrediram para se tornarem MPNSTs e, portanto, apenas parcialmente imitaram a biologia de seus homólogos humanos. A patogênese do MPNST ocorreu quando mutações Nf1 foram associadas a mutações em genes supressores de tumor adicionais, como Trp539 ou Cdkn2a10, mas os MPNSTs nesses modelos GEM se desenvolveram de novo ou a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs)11,12, em vez de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver13,14 para excelentes revisões desses modelos, bem como de outros modelos introduzindo mutações adicionais associadas à perda de função do MPNST em genes como Suz12 e Pten15).
Esses modelos em camundongos têm sido inestimáveis para estabelecer o papel que genes como NF1, TP53 e CDKN2A desempenham na patogênese de neoplasias do sistema nervoso periférico associadas à NF1 e para ensaios pré-clínicos testando candidatos a agentes terapêuticos. No entanto, ainda temos uma compreensão incompleta do processo pelo qual os neurofibromas plexiformes progridem para se tornarem neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs16) e, em seguida, MPNSTs. Recentemente, alguns progressos foram feitos na compreensão desse processo com o recente relatório de que camundongos com exclusões em Nf1 e Arf desenvolvem ANNUBPs que progridem para se tornarem MPNSTs11. No entanto, modelos de camundongos baseados em mutação Nf1 que recapitulam completamente o processo de progressão plexiforme do neurofibroma-MPNST observado em humanos ainda não existem. Além disso, não está claro se existem múltiplas vias distintas que levam ao desenvolvimento de MPNSTs. Diante disso, é possível que os GEMs descritos acima modelem apenas um subconjunto de várias vias diferentes que levam à progressão do neurofibroma-MPNST e patogênese do MPNST. Esse ponto é enfatizado pelo fato de que as MPNSTs também ocorrem esporadicamente e que algumas MPNSTs esporádicas aparentemente não apresentam mutações naNF117,18.
Embora este último ponto tenha sido contestado pela recente sugestão de Magollon-Lorenz e col. de que pelo menos alguns MPNSTs esporádicos sem mutações na NF1 são melanomas ou um tipo diferente desarcoma19, recentemente relatamos um MPNST esporádico e uma linhagem celular derivada desse tumor (células 2XSB) que era NF1 selvagem-tipo20. Durante a caracterização do tumor de origem e da linhagem celular 2XSB, sistematicamente descartamos possibilidades diagnósticas alternativas, incluindo melanoma e os múltiplos outros tipos de sarcoma que são rotineiramente considerados no diagnóstico diferencial de um tumor esporádico maligno de bainha de nervoperiférico20. Além disso, observamos que Magollon-Lorenz e col. reconheceram que seus achados nas três linhagens esporádicas de MPNST que estudaram não puderam ser generalizados para indicar que todos os tumores identificados como MPNSTs esporádicos não são MPNSTs.
Para construir um modelo de GEM no qual o neurofibroma e a patogênese do MPNST não fossem necessariamente dependentes de mutações específicas no gene supressor de tumor, geramos camundongos transgênicos nos quais a superexpressão da potente neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) foi impulsionada pelo promotor zero (P0) da proteína mielina específica da célula de Schwann (camundongos P 0-GGFβ3)21. Demonstramos anteriormente que neurofibromas humanos, MPNSTs e linhagens celulares MPNST expressam várias isoformas de NRG1 juntamente com as tirosina quinases do receptor erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) que medeiam a sinalização NRG1 e que esses receptores erbB são constitutivamente ativados22. Também demonstramos que os inibidores farmacológicos das quinases erbB inibem potentemente a proliferação do MPNST22, a sobrevivência23 e a migração24. De acordo com nossas observações em humanos, camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes25 que progridem para se tornarem MPNSTs em alta frequência21,25. Demonstramos que MPNSTs P 0-GGFβ3, assim como seus homólogos humanos, comumente desenvolvem mutações de Trp53 e Cdkn2a, bem como inúmeras outras anormalidades genômicas que potencialmente contribuem para a tumorigênese25. MPNSTs que surgem em camundongos P 0-GGFβ3 não apresentam mutações Nf1 inativadoras. Entretanto, utilizando complementação genética, mostramos que NRG1 promove tumorigênese em camundongos P 0-GGFβ3 predominantemente através das mesmas cascatas de sinalização que são alteradas pela perda de Nf1 26; esta conclusão é baseada em nosso achado de que a substituição da superexpressão de NRG1 pela perda de Nf1 na presença de haploinsuficiência de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- camundongos) produz animais nos quais MPNSTs se desenvolvem de novo, como é visto em cis-Nf1+/-; Ratos Trp53+/- 27.
Para obter essas e outras informações que demonstrem que camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos de patogênese do neurofibroma e progressão do neurofibroma-MPNST observados em humanos com NF1, desenvolvemos metodologias especializadas para o processamento de tecidos desses animais, diagnosticando com precisão seus tumores, classificando os MPNSTs surgidos nesses camundongos, estabelecendo e caracterizando P0-GGFβ3 e P0-GGFβ3 de passagem precoce; Culturas de Trp53+/- MPNST e comparação crítica da patologia de P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs ao de seus homólogos humanos. Muitas dessas metodologias são generalizáveis para outros modelos de GEM de neoplasia do sistema nervoso. Além disso, várias dessas metodologias são mais amplamente aplicáveis a modelos de GEM, nos quais neoplasias surgem em outros sítios orgânicos. Consequentemente, apresentamos aqui uma descrição detalhada dessas metodologias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos histológicos e bioquímicos aqui apresentados fornecem uma estrutura para diagnosticar e caracterizar modelos de GEMs na patogênese do neurofibroma e do MPNST. Ao longo dos anos, essas metodologias têm sido bastante úteis para avaliar a patologia dos tumores da bainha dos nervos periféricos que surgem em modelos deGEM21,25,26. No entanto, embora os protocolos aqui descritos sejam úteis para determinar com que p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 para S.L.C.; R01 NS109655-03S1 para D.P.J.), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 para S.L.C.) e o Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 para S.L.C.).
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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