Identificazione, diagnosi e classificazione dei tumori maligni della guaina dei nervi periferici in modelli murini geneticamente modificati
Summary
Abbiamo sviluppato una metodologia per valutare se le neoplasie del sistema nervoso nei topi geneticamente modificati ricapitolano accuratamente la patologia delle loro controparti umane. Qui, applichiamo queste tecniche istologiche, i criteri patologici definiti e le metodologie di coltura ai neurofibromi e ai tumori maligni della guaina dei nervi periferici che insorgono nel modello murino P 0-GGFβ3.
Abstract
I pazienti con la sindrome da suscettibilità al tumore autosomico dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) sviluppano comunemente neurofibromi plessiformi (PN) che successivamente si trasformano in tumori maligni altamente aggressivi della guaina dei nervi periferici (MPNST). La comprensione del processo attraverso il quale un PN si trasforma in un MPNST sarebbe facilitata dalla disponibilità di modelli murini geneticamente modificati (GEM) che replicano accuratamente la progressione PN-MPNST osservata negli esseri umani con NF1. Sfortunatamente, i modelli GEM con ablazione di Nf1 non ricapitolano completamente questo processo. Questo ci ha portato a sviluppare topi P 0-GGFβ3, un modello GEM in cui la sovraespressione del mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) nelle cellule di Schwann provoca lo sviluppo di PN che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza. Tuttavia, per determinare se la tumorigenesi e la progressione neoplastica nei topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi osservati nei pazienti NF1, abbiamo dovuto prima dimostrare che la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica P0-GGFβ3 ricapitola la patologia delle loro controparti umane.
In questo articolo, descriviamo le metodologie specializzate utilizzate per diagnosticare e classificare accuratamente le neoplasie del sistema nervoso periferico in modelli GEM, utilizzando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Trp53+/- topi come esempio. Descriviamo i metodi istologici, immunoistochimici e istochimici utilizzati per diagnosticare PN e MPNST, come distinguere queste neoplasie da altri tipi di tumore che ne imitano la patologia e come classificare queste neoplasie. Discutiamo la creazione di colture di passaggio precoce da MPNST GEM, come caratterizzare queste colture utilizzando l’immunocitochimica e come verificare la loro tumorigenicità stabilendo allotrapianti. Collettivamente, queste tecniche caratterizzano la patologia dei PN e degli MPNST che insorgono nei modelli GEM e confrontano criticamente la patologia di questi tumori murini con le loro controparti umane.
Introduction
Negli ultimi tre decenni, numerosi laboratori hanno tentato di creare modelli murini di tumori umani introducendo mutazioni associate al cancro umano nel genoma del topo o sovraesprimendo un prodotto genico che è sovraespresso nei tumori umani. I modelli murini geneticamente modificati (GEM) risultanti possono essere utilizzati per una varietà di scopi, come stabilire che la modifica genomica di nuova introduzione avvia la tumorigenesi, identificare altri cambiamenti genetici o epigenetici che si verificano successivamente che contribuiscono alla progressione del tumore e definire le vie di segnalazione chiave che guidano l’inizio e la progressione del tumore. A differenza dei modelli di xenotrapianto ortotopico, che si basano sull’uso di topi immunodeficienti, i modelli di cancro GEM hanno un sistema immunitario completamente funzionale e quindi modellano in modo più accurato le risposte agli agenti terapeutici candidati. Tuttavia, quando si utilizzano modelli di cancro GEM per scopi come questi, è essenziale che i ricercatori confermino che le osservazioni fatte con le neoplasie GEM sono rilevanti per le loro controparti umane. Tale convalida deve includere una valutazione approfondita della patologia delle neoplasie GEM e la determinazione se le caratteristiche patologiche delle neoplasie GEM ricapitolano la patologia del corrispondente tipo di tumore umano.
La sindrome da suscettibilità al tumore neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è la malattia genetica più comune che colpisce il sistema nervoso umano, che si verifica in circa 1 ogni 3.000-3.500 nati vivi 1,2,3. Gli individui affetti da NF1 sviluppano tumori multipli benigni della guaina nervosa periferica noti come neurofibromi nella pelle (neurofibromi dermici) e nei grandi nervi e plessi nervosi (neurofibromi plessiformi). Mentre sia i neurofibromi cutanei che quelli plessiformi peggiorano la qualità della vita del paziente producendo compromissione fisica, comportamentale e/o sociale, i neurofibromi plessiformi (PN) sono particolarmente pericolosi 4,5. Ciò è dovuto al fatto che i PN si trasformano spesso in tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST), che sono neoplasie aggressive a cellule fusiformi con un tasso di sopravvivenza eccezionalmente basso 1,2. In gran parte, questo basso tasso di sopravvivenza è dovuto al fatto che i regimi radioterapici e chemioterapici attualmente utilizzati per trattare le MPNST sono inefficaci. Tuttavia, lo sviluppo di nuove terapie più efficaci è stato impegnativo. Questo perché, nonostante la frequenza con cui le MPNST si verificano nei pazienti NF1, si tratta comunque di neoplasie rare. Di conseguenza, è molto difficile ottenere un gran numero di tumori umani da studiare; è anche difficile reclutare un numero sufficiente di pazienti con MPNST per gli studi clinici. Per superare queste limitazioni, sono stati generati diversi modelli GEM con l’obiettivo di ottenere ulteriori informazioni sulle anomalie che guidano la patogenesi del neurofibroma e la progressione del PN-MPNST e di facilitare gli studi preclinici con agenti terapeutici candidati.
I pazienti affetti da NF1 presentano mutazioni inattivanti in una copia del gene NF1. La patogenesi del neurofibroma si innesca quando si verifica una mutazione inattivante nel gene NF1 funzionale rimanente in una cellula della linea cellulare di Schwann. Sorprendentemente, tuttavia, quando i topi sono stati generati con mutazioni Nf1 inattivanti la linea germinale, non hanno sviluppato neurofibromi 6,7. La successiva dimostrazione che topi con cellule di Schwann Nf1-null e aploinsufficienza di Nf1 in tutti gli altri tipi cellulari (Krox20-Cre;Nf1flox/- topi) hanno sviluppato neurofibromi plessiformi hanno suggerito che per la patogenesi del neurofibroma8 era necessario un dosaggio ridotto del gene Nf1 in altri tipi di cellule. Anche allora, i neurofibromi plessiformi in Krox20-Cre; I topi flox/- Nf1 non sono progrediti fino a diventare MPNST e quindi hanno imitato solo parzialmente la biologia delle loro controparti umane. La patogenesi delle MPNST si è verificata quando le mutazioni di Nf1 sono state associate a mutazioni in altri geni oncosoppressori come Trp539 o Cdkn2a10, ma le MPNST in questi modelli GEM si sono sviluppate de novo o da neoplasie neurofibromatiche atipiche a potenziale biologico incerto (ANNUBPs)11,12, piuttosto che da neurofibromi plessiformi benigni preesistenti (vedi13,14 per eccellenti revisioni di questi modelli e di altri modelli che introducono ulteriori mutazioni con perdita di funzione associate a MPNST in geni come Suz12 e Pten15).
Questi modelli murini sono stati preziosi per stabilire il ruolo che geni come NF1, TP53 e CDKN2A svolgono nella patogenesi delle neoplasie del sistema nervoso periferico associate a NF1 e per studi preclinici che testano agenti terapeutici candidati. Tuttavia, abbiamo ancora una comprensione incompleta del processo attraverso il quale i neurofibromi plessiformi progrediscono fino a diventare neoplasie neurofibromatiche atipiche di potenziale biologico incerto (ANNUBPs16) e quindi MPNST. Recentemente sono stati compiuti alcuni progressi nella comprensione di questo processo con il recente rapporto secondo cui i topi con delezioni in Nf1 e Arf sviluppano ANNUBP che progrediscono fino a diventare MPNST11. Tuttavia, non esistono ancora modelli murini basati sulla mutazione di Nf1 che ricapitolano completamente il processo di progressione del neurofibroma plessiforme-MPNST osservato nell’uomo. Inoltre, non è chiaro se esistano più percorsi distinti che portano allo sviluppo di MPNST. Alla luce di ciò, è possibile che i GEM sopra descritti modellino solo un sottoinsieme di diversi percorsi che portano alla progressione del neurofibroma-MPNST e alla patogenesi del MPNST. Questo punto è enfatizzato dal fatto che le MPNST si verificano anche sporadicamente e che alcune MPNST sporadiche apparentemente non hanno mutazioni NF1 17,18.
Sebbene quest’ultimo punto sia stato messo in discussione dal recente suggerimento di Magollon-Lorenz et al. secondo cui almeno alcuni MPNST sporadici privi di mutazioni NF1 sono melanomi o un diverso tipo di sarcoma19, abbiamo recentemente riportato un MPNST sporadico e una linea cellulare derivata da questo tumore (cellule 2XSB) che era NF1 wild-type20. Durante la caratterizzazione del tumore genitore e della linea cellulare 2XSB, abbiamo sistematicamente escluso possibilità diagnostiche alternative, tra cui il melanoma e i molteplici altri tipi di sarcoma che sono considerati di routine nella diagnosi differenziale di un tumore maligno sporadico della guaina dei nervi periferici20. Inoltre, notiamo che Magollon-Lorenz et al. hanno riconosciuto che i loro risultati nelle tre linee cellulari MPNST sporadiche che hanno studiato non potevano essere generalizzati per indicare che tutti i tumori identificati come MPNST sporadici non lo sono.
Per costruire un modello GEM in cui il neurofibroma e la patogenesi di MPNST non dipendessero necessariamente da specifiche mutazioni del gene oncosoppressore, abbiamo generato topi transgenici in cui la sovraespressione del potente mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) era guidata dal promotore della proteina mielinica zero (P0) specifica per le cellule di Schwann (topi P 0-GGFβ3)21. Abbiamo precedentemente dimostrato che i neurofibromi umani, gli MPNST e le linee cellulari MPNST esprimono diverse isoforme NRG1 insieme alle tirosin-chinasi del recettore erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) che mediano la segnalazione di NRG1 e che questi recettori erbB sono costitutivamente attivati22. Abbiamo anche dimostrato che gli inibitori farmacologici delle chinasi erbB inibiscono potentemente la proliferazioneMPNST 22, la sopravvivenza23 e la migrazione24. In linea con le nostre osservazioni nell’uomo, i topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi25 che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza21,25. Abbiamo dimostrato che le MPNST P 0-GGFβ3, come le loro controparti umane, sviluppano comunemente mutazioni di Trp53 e Cdkn2a, così come numerose altre anomalie genomiche che potenzialmente contribuiscono alla tumorigenesi25. Le MPNST che insorgono nei topi P 0-GGFβ3 non hanno mutazioni inattivanti di Nf1. Tuttavia, utilizzando la complementazione genetica, abbiamo dimostrato che NRG1 promuove la tumorigenesi nei topi P 0-GGFβ3 prevalentemente attraverso le stesse cascate di segnalazione che sono alterate dalla perdita di Nf1 26; questa conclusione si basa sulla nostra scoperta che la sostituzione della sovraespressione di NRG1 con la perdita di Nf1 in presenza di aploinsufficienza di Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- topi) produce animali in cui le MPNST si sviluppano de novo, come si vede in cis-Nf1+/-; Trp53+/- topi27.
Per ottenere queste e altre informazioni che dimostrino che i topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST osservati nell’uomo con NF1, abbiamo sviluppato metodologie specializzate per l’elaborazione dei tessuti di questi animali, la diagnosi accurata dei loro tumori, la classificazione delle MPNST che insorgono in questi topi, la determinazione e la caratterizzazione di P0-GGFβ3 e P0-GGFβ3 a passaggio precoce; colture di Trp53+/- MPNST e confronto critico della patologia di P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P 0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST a quello delle loro controparti umane. Molte di queste metodologie sono generalizzabili ad altri modelli GEM di neoplasia del sistema nervoso. Inoltre, molte di queste metodologie sono più ampiamente applicabili a modelli GEM in cui le neoplasie insorgono in altre sedi d’organo. Di conseguenza, qui presentiamo una descrizione dettagliata di queste metodologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi istologici e biochimici qui presentati forniscono un quadro di riferimento per la diagnosi e la caratterizzazione di modelli GEM di neurofibroma e patogenesi MPNST. Nel corso degli anni, abbiamo trovato queste metodologie molto utili per valutare la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica che insorgono nei modelli GEM 21,25,26. Tuttavia, mentre i protocolli qui delineati sono utili per determinare l’accurat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), il National Cancer Institute (R01 CA122804 a S.L.C.) e il Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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