Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

Summary

Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.

Abstract

Nous avons optimisé un protocole d’inoculation des gaines foliaires du maïs avec des champignons pathogènes foliaires hémibiotrophes et nécrotrophes. La méthode est modifiée par rapport à celle appliquée à l’origine aux gaines des feuilles de riz et permet une observation microscopique directe de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes. Les gaines foliaires prélevées sur des semis de maïs dont le collet est entièrement levé sont inoculées avec 20 μL de suspensions de spores fongiques de 5 x 10⁵ spores/mL et incubées dans des chambres humides à 23 °C sous une lumière fluorescente continue. Après 24 à 72 h, l’excès de tissu est retiré avec une lame de rasoir pour laisser une seule couche de cellules épidermiques, un échantillon optiquement clair qui peut être imagé directement sans qu’il soit nécessaire de fixer ou de nettoyer chimiquement. Les cellules végétales et fongiques restent vivantes pendant toute la durée de l’expérience et les interactions peuvent être visualisées en temps réel. Les gaines peuvent être colorées ou soumises à une plasmolyse pour étudier la cytologie du développement et la viabilité des cellules hôtes et pathogènes au cours de l’infection et de la colonisation. Les souches fongiques transformées pour exprimer des protéines fluorescentes peuvent être inoculées ou co-inoculées sur les gaines pour une résolution accrue et pour faciliter l’évaluation des interactions compétitives ou synergiques. Les souches fongiques exprimant des protéines de fusion fluorescentes peuvent être utilisées pour suivre et quantifier la production et le ciblage de ces protéines individuelles in planta. Les tissus de gaine inoculés peuvent être extraits pour caractériser les acides nucléiques, les protéines ou les métabolites. L’utilisation de ces essais de gaine a considérablement fait progresser les études détaillées des mécanismes de pathogénicité fongique chez le maïs, ainsi que des effecteurs protéiques fongiques et des métabolites secondaires contribuant à la pathogénicité.

Introduction

Les analyses spatiales et temporelles au niveau cellulaire sont essentielles pour comprendre la physiologie et la cytologie des interactions fongiques-plantes. Les tissus foliaires qui ont été fixés chimiquement ^1,2,3 ou nettoyés et colorés⁴, ainsi que les membranes artificielles^5, ont été utilisés dans le passé pour étudier la cytologie du développement des agents pathogènes foliaires et les interactions plantes-champignons. Cependant, l’étude des événements infectieux dans les tissus de l’hôte vivant en temps réel sans fixatio....

Protocol

REMARQUE : Le flux de travail de la méthode est illustré à la figure 1.

Figure 1 : Étapes du protocole d’inoculation optimisé à l’aide de gaines de feuilles de maïs détachées. La préparation de la suspension de spores, l’inoculation de la gaine foliaire et la préparation d’échantillons pour la microscopie de cellules vivantes sont surlignées dans des cases vertes (A), violettes (B....

Results

Les exemples ci-dessous décrivent des résultats représentatifs de l’utilisation de la méthode d’inoculation de la gaine des feuilles de maïs. Ces exemples démontrent la facilité, la rapidité et la précision avec lesquelles l’observation et la comparaison des interactions maïs-champignon peuvent être réalisées en temps réel avec ce test optimisé. L’imagerie de cellules vivantes permet également d’extraire des informations quantitatives, ce qui constitue un outil utile pour les études moléculaires, cytologiques et physiolo.......

Discussion

La méthode optimisée d’inoculation de la gaine foliaire décrite ici est modifiée à partir d’un protocole original qui a été développé et appliqué aux gaines foliaires du riz ^6,8,36. Il permet des observations directes et détaillées de la croissance et du développement fongiques dans les cellules végétales vivantes par microscopie à grand champ ou confocale. Le protocole est adapté à la caractérisation, à la comparaison et à la q.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caméra microscope monochrome Axiocam	ZEISS	426560-9010-000	Compatible avec le microscope Axioplan 2 ; offre un faible bruit de lecture et une vitesse élevée pour l’imagerie de cellules vivantes
Microscope à épifluorescence Axioplan 2	ZEISS	N/A	Permet la visualisation en direct et la capture d’images/vidéos. d’échantillons biologiques  ;
Centrifugeuse de paillasse 24 X 1,5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17 ; vitesse maximale : 13 300 tr/min (17 000 x g)
Boîte de Pétri bactériologique Falcon avec couvercle	Fisher Scientific	08-757-105	Matériau en polystyrène ; surface hydrophobe
Papier filtre  ;	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 pour les chambres humides à plaque de Pétri
FV 3000 microscope confocal à balayage laser	Olympus	N/A	Pour la visualisation des transformants fongiques
Papier de germination	Anchor Paper Co.	SD7615L	76 # poids lourd pour boîte en plastique chambres humides Boîtes
de Pétri en verre	VWR International	75845-542	Type 1 classe A, 33 verre borosilicaté à expansion ; kit complet (couvercle + fond), pour plaque de Pétri chambres humides
Laine de verre  ;	Chimie de spécialité de la vallée de l’Ohio  ;	3350	Pour les unités de filtration en laine de verre
Hémocytomètre/Neubauer, chambre de comptage et verre de protection	VWR International	15170-172 Profondeur de	chambre de 0,1 mm ; livré avec deux verres de protection de 0,4 mm
Lamelles de microscope	Fisher Scientific	12-553-457	Verre borosilicaté ; 100/pqt ; 22 mm de longueur, 22 mm de largeur
Cultivar de maïs Golden Jubilee	seeds West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures  ; dans 95 à 105 jours ; type de graine : F1
Tubes à microcentrifuger  ;	USA Scientific  ;   ;	1415-2500	Capacité de 1,5 mL
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-123  ;	Glissière à languette Superfrost blanche ; 76 mm de longueur, 25 mm de largeur
Gélose à l’avoine (OA)	VWR International	255210	Difco Gélose à l’avoine, BD ; 500 g
Vernis à ongles	Revlon	43671	Vernis à ongles transparent pour l’étanchéité des lames de microscope ; couleur 771
Transparent Plaque PCR 96 puits sans jupe	USA Sientific	1402-9500	Volume de la plaque 100 uL
Pilon pour tubes à microcentrifuger	USA Scientific  ;	1415-5390	Pointe conique ; matériau polypropylène
PlanApo 60X/1,00 WLSM objectif d’eau  ;	Olympus	1-UB933	Compatible avec le microscope confocal Olympus FV 3000
Gélose au dextrose de pomme de terre (PDA)	VWR International	90000-758	Média de dextrose de pomme de terre Difco, BD ; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Substrat de culture à usage général de qualité supérieure formulé pour fournir a  ; équilibre entre la rétention d’eau et le bon drainage
SC10 cônes  ;	Serre Megastore  ;	CN-SS-SC-10B	Plateau de 1,5 pouce de diamètre, 8,25 pouces de profondeur et d’un volume de 164 mL
SC10		CN-SS-SCTR98	24 pouces de longueur x 12 pouces de largeur x 6,75 pouces de hauteur ; peut contenir jusqu’à 98 cônes SC10
Lame de rasoir à un seul tranchant	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	Lame AccuTec ; matériau en acier ; lame de 38 mm
de longueur Contenants/boîtes de stockage avec fermeture à loquet	Cible	002-02-0405	Boîtes de rangement à vue claire pour chambre humide ; Dimensions extérieures : 23 5/8 po x 16 3/8 po x 6 1/2 po ; Capacité de 32 pintes