Intratekal injeksjon av nyfødt mus for genomredigering og legemiddellevering
Summary
Den nåværende protokollen skisserer trinnvise instruksjoner for å utføre intratekale injeksjoner i nyfødte mus for genredigering og legemiddellevering.
Abstract
Intratekal injeksjon er en vanlig prosedyre i både pediatriske og voksne klinikker, som tjener som et effektivt middel til å administrere medisiner og behandlinger. Ved direkte å levere medisiner og behandlinger i cerebrospinalvæsken i sentralnervesystemet, oppnår denne metoden høyere lokaliserte legemiddelkonsentrasjoner samtidig som systemiske bivirkninger reduseres sammenlignet med andre ruter som intravenøse, subkutane eller intramuskulære injeksjoner. Dens betydning strekker seg utover kliniske innstillinger, da intratekal injeksjon spiller en viktig rolle i prekliniske studier fokusert på behandling av nevrogenetiske lidelser hos gnagere og andre store dyr, inkludert ikke-menneskelige primater. Til tross for den utbredte anvendelsen, utgjør intratekal injeksjon hos unge, spesielt nyfødte valper, betydelige tekniske utfordringer på grunn av deres lille størrelse og skjøre natur. Vellykket og pålitelig administrering av intratekale injeksjoner hos nyfødte mus krever nøye oppmerksomhet på detaljer og nøye vurdering av ulike faktorer. Det er derfor et avgjørende behov for en standardisert protokoll som ikke bare gir instruksjoner, men også fremhever viktige tekniske hensyn og god laboratoriepraksis for å sikre prosessuell konsistens, samt dyrenes sikkerhet og velferd.
For å imøtekomme dette udekkede behovet, presenterer vi en detaljert og omfattende protokoll for å utføre intratekale injeksjoner spesifikt hos nyfødte avkom på postnatal dag 1 (P1). Ved å følge trinnvise instruksjoner, kan forskere trygt utføre intratekale injeksjoner i nyfødte valper, noe som muliggjør nøyaktig levering av medisiner, antisense oligos og virus for genutskifting eller genomredigeringsbaserte behandlinger. Videre understrekes viktigheten av å følge god laboratoriepraksis for å opprettholde dyrs velvære og sikre pålitelige eksperimentelle resultater. Denne protokollen tar sikte på å løse de tekniske utfordringene knyttet til intratekale injeksjoner i nyfødte mus, og til slutt legge til rette for fremskritt innen nevrogenetisk forskning som tar sikte på å utvikle potensielle terapeutiske inngrep.
Introduction
Intratekal (IT) injeksjon er en vanlig klinisk prosedyre som brukes til å administrere medisiner, samle cerebrospinalvæske og opprettholde intrakranielt trykk hos både pediatriske og voksne pasienter i klinikker 1,2. Administrering av medisiner via intratekal injeksjon er en effektiv tilnærming for å øke medisinkonsentrasjonen i sentralnervesystemet (CNS) samtidig som systemisk eksponering minimeres. Følgelig forbedrer denne metoden terapeutisk effekt og reduserer bivirkninger, spesielt for temperaturfølsomme og korte halveringstidsmedikamenter3.
I prekliniske studier som tester nye stoffer og behandlinger ved hjelp av gnagermodeller, er det viktig å bruke en pålitelig metode for legemiddeladministrasjon som gir større presisjon og resultatreproduserbarhet 4,5. For prekliniske studier som evaluerer nye behandlinger for nevrogenetiske og nevrodevelopmental lidelser, er tidlig behandling avgjørende for innledende proof-of-concept-studier fordi tidligere intervensjoner vanligvis forventes å gi gunstigere resultater 6,7,8.
Sammenlignet med konvensjonelle intracerebroventrikulære (ICV) injeksjoner, har IT-injeksjoner betydelig lavere risiko siden de unngår behovet for direkte penetrasjon gjennom hjernebarken. Denne fordelen reduserer den potensielle skaden på regionalt kortikalt vev og omkringliggende nerver betydelig. Videre tillater IT-injeksjoner minst en femdobling i det administrerbare volumet av medisiner gjennom en enkelt injeksjon, noe som øker muligheten for gjentatte administrasjoner. På grunn av den lille størrelsen og skjøre naturen til nyfødte mus, er det imidlertid teknisk utfordrende å utføre intratekale injeksjoner hos nyfødte valper og krever spesialiserte teknikker, utstyr og grundig håndtering.
Denne artikkelen gir en detaljert protokoll med trinnvise instruksjoner for å utføre intratekale injeksjoner i P1 nyfødte valper. De viktigste hensynene og god laboratoriepraksis vektlegges her for å sikre konsistent administrasjon og dyrenes sikkerhet og trivsel under prosedyren. Ved å følge denne protokollen kan forskere trygt utføre eksperimenter med presisjon og reproduserbarhet samtidig som potensielle risikoer eller ubehag for dyrene minimeres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet er en trinnvis prosedyre for intratekal injeksjon hos nyfødte mus (P1), noe som resulterer i utbredt legemiddeldistribusjon i hjernen. I forhold til den vanlige intracerebroventrikulære injeksjonsmetoden for å levere medisiner til nyfødte mus, som innebærer piercing av hjernebarken11, unngår intratekal injeksjon direkte skade på den neonatale musehjernen på grunn av nålpenetrasjon. På grunn av minimal invasivitet kan intratekal injeksjon utføres gjentatte ganger når det er n?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL støttes av Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ støttes også av FAST og NIH Grant R01HD110195 og R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
