ज़ेनोपस टैडपोल में रेटिना चोट मॉडल उत्पन्न करना
Summary
हमने ज़ेनोपस लाविस टैडपोल में रेटिना क्षति या रेटिना अध: पतन को प्रेरित करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। ये मॉडल रेटिना पुनर्जनन तंत्र का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करते हैं।
Abstract
रेटिना न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अंधापन के प्रमुख कारण हैं। कई चिकित्सीय रणनीतियों का पता लगाया जा रहा है, हाल ही में आत्म-मरम्मत को उत्तेजित करना विशेष रूप से आकर्षक के रूप में उभरा। रेटिना की मरम्मत के लिए ब्याज का एक सेलुलर स्रोत मुलर ग्लियल सेल है, जो स्टेम सेल क्षमता और एनामोट्स में एक असाधारण पुनर्योजी क्षमता को परेशान करता है। हालांकि, स्तनधारियों में यह क्षमता बहुत सीमित है। पुनर्योजी क्षमताओं के साथ पशु मॉडल में रेटिना पुनर्जनन अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन कैसे स्तनधारी मुलर कोशिकाओं की अव्यक्त क्षमता को अनलॉक करने के लिए रेटिना पुनर्जीवित करने के लिए में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए. पुनर्योजी चिकित्सा में चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है। इस उद्देश्य के लिए, हमने ज़ेनोपस में कई रेटिना चोट प्रतिमान विकसित किए: एक यांत्रिक रेटिना चोट, एक ट्रांसजेनिक लाइन जो नाइट्रोरेडक्टेस-मध्यस्थता फोटोरिसेप्टर सशर्त पृथक्करण के लिए अनुमति देती है, सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट पर आधारित एक रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा मॉडल, और इंट्राओकुलर सीओसीएल2 इंजेक्शन द्वारा संचालित एक साइटोटोक्सिक मॉडल। उनके फायदे और नुकसान पर प्रकाश डालते हुए, हम यहां प्रोटोकॉल की इस श्रृंखला का वर्णन करते हैं जो विभिन्न अपक्षयी स्थितियों को उत्पन्न करते हैं और ज़ेनोपस में रेटिना पुनर्जनन के अध्ययन की अनुमति देते हैं।
Introduction
दुनिया भर में लाखों लोग विभिन्न रेटिना अपक्षयी रोगों से पीड़ित हैं, जो अंधापन की ओर ले जाते हैं, जैसे कि रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, डायबिटिक रेटिनोपैथी, या उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी)। आज तक, ये स्थितियां काफी हद तक अनुपचार्य बनी हुई हैं। मूल्यांकन के तहत वर्तमान चिकित्सीय दृष्टिकोणों में जीन थेरेपी, सेल या ऊतक प्रत्यारोपण, न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार, ऑप्टोजेनेटिक्स और प्रोस्थेटिक डिवाइस शामिल हैं। एक और उभरती हुई रणनीति स्टेम सेल क्षमता के साथ अंतर्जात कोशिकाओं के सक्रियण के माध्यम से आत्म-उत्थान पर आधारित है। मुलर ग्लियाल कोशिकाएं, रेटिना के प्रमुख ग्लियल सेल प्रकार, इस संदर्भ में रुचि के सेलुलर स्रोतों में से हैं। चोट लगने पर, वे विभेदन, प्रसार कर सकते हैं, और न्यूरॉन्स 1,2,3 उत्पन्न कर सकते हैं। यद्यपि यह प्रक्रिया ज़ेब्राफिश या ज़ेनोपस में बहुत प्रभावी है, लेकिन स्तनधारियों में यह काफी हद तक अक्षम है।
फिर भी, यह दिखाया गया है कि मिटोजेनिक प्रोटीन या विभिन्न कारकों की अतिअभिव्यक्ति के साथ उपयुक्त उपचार स्तनधारी मुलर ग्लिया सेल-चक्र पुन: प्रवेश को प्रेरित कर सकते हैं और कुछ मामलों में, उनके बाद के न्यूरोजेनेसिस प्रतिबद्धता 1,2,3,4,5 को ट्रिगर कर सकते हैं। हालांकि, यह उपचार के लिए काफी हद तक अपर्याप्त है। इसलिए, पुनर्जनन अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को बढ़ाना मुलर स्टेम जैसी सेल गुणों को नई सेलुलर चिकित्सीय रणनीतियों में कुशलतापूर्वक बदलने में सक्षम अणुओं की पहचान करना आवश्यक है।
इस उद्देश्य के साथ, हमने ज़ेनोपस में कई चोट प्रतिमान विकसित किए जो रेटिना सेल अपघटन को ट्रिगर करते हैं। यहां, हम (1) एक यांत्रिक रेटिना की चोट पेश करते हैं जो सेल प्रकार-विशिष्ट नहीं है, (2) एनटीआर-एमटीजेड प्रणाली का उपयोग करके एक सशर्त और प्रतिवर्ती सेल पृथक्करण मॉडल जो रॉड कोशिकाओं को लक्षित करता है, (3) एक सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता रोडोप्सिन नॉकआउट, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा का एक मॉडल जो प्रगतिशील रॉड सेल अपघटन को ट्रिगर करता है, और (4) एक सीओसीएल2-प्रेरित साइटोटोक्सिक मॉडल जो खुराक के अनुसार विशेष रूप से शंकु को लक्षित कर सकता है या व्यापक रेटिना सेल अध: पतन का कारण बन सकता है। हम प्रत्येक प्रतिमान की विशिष्टताओं, फायदे और नुकसान पर प्रकाश डालते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ज़ेनोपस टैडपोल में विभिन्न रेटिना चोट प्रतिमानों के फायदे और नुकसान
यांत्रिक रेटिना की चोट
ज़ेनोपस टैडपोल में तंत्रिका रेटिना की विभिन्न सर्जिकल चोटें विकसित की गई ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एसोसिएशन रेटिना फ्रांस, फोंडेशन डी फ्रांस, एफएमआर (फोंडेशन मैलेडीज रेरेस), बीबीएस (एसोसिएशन डू सिंड्रोम डी बार्डेट-बिडल), और यूएनएडीईडब्ल्यूई (यूनियन नेशनेल डेस एवेगल्स एट डेफिसिएंट्स विसुएल्स) से एमपी को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
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