Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Résumé

Le réseau de microtubules est une composante essentielle du système nerveux. Des mutations dans de nombreuses protéines régulatrices des microtubules sont associées à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurologiques, telles que la protéine Tau associée aux microtubules aux maladies neurodégénératives, la protéine sectionnante des microtubules Spastin et Katanin 60 provoquent respectivement une paraplégie spastique héréditaire et des anomalies neurodéveloppementales. La détection de réseaux de microtubules dans les neurones est avantageuse pour élucider la pathogenèse des troubles neurologiques. Cependant, la petite taille des neurones et la disposition dense des faisceaux de microtubules axonaux rendent difficile la visualisation des réseaux de microtubules. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire et des cellules musculaires, ainsi que l’immunomarquage de la α-tubuline et de la protéine de Futsch associée aux microtubules pour visualiser les réseaux de microtubules chez Drosophila melanogaster. La jonction neuromusculaire nous permet d’observer à la fois les microtubules pré et post-synaptiques, et la grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Ici, en mutant et en surexprimant Katanin 60 chez Drosophila melanogaster, puis en examinant les réseaux de microtubules dans la jonction neuromusculaire et les cellules musculaires, nous révélons avec précision le rôle régulateur de Katanin 60 dans le neurodéveloppement. Par conséquent, combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Introduction

Les microtubules (MT), en tant que l’un des composants structurels du cytosquelette, jouent un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la division cellulaire, la croissance et la motilité cellulaires, le transport intracellulaire et le maintien de la forme cellulaire. La dynamique et la fonction des microtubules sont modulées par des interactions avec d’autres protéines, telles que MAP1, MAP2, Tau, Katanine et Kinésine 1,2,3,4,5.

Dans les neurones, les microtu....

Protocole

1. Dissection des larves

REMARQUE : La solution de dissection solution saline de type hémolymphatique (HL3.1)¹⁸ et la solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde (PFA)^19,20 sont utilisées à température ambiante car les microtubules se dépolymérisent lorsque la température est trop basse.

1. Repérez une larve errante du 3^e stade à l’aide d’une longue pince émoussée. Lavez-le avec HL3.1 et placez-le sur la boîte de dissection sous le stéréomicroscope.
   NOTA : La larve errante du 3^e stade larvaire est identifiée ....

Résultats

Nous avons démontré une procédure étape par étape pour visualiser le réseau de microtubules dans les jonctions neuromusculaires (JNM) et les cellules musculaires. Après la dissection selon le schéma de principe (Figure 1A-E), l’immunomarquage est effectué, puis les images sont observées et recueillies sous un microscope confocal laser ou un microscope à fluorescence stéréoscopique (Figure 1F,G).

L’org.......

Discussion

Un protocole est décrit ici pour la dissection et l’immunomarquage des jonctions neuromusculaires et des cellules musculaires des larves de drosophile . Il y a plusieurs points essentiels à considérer. Tout d’abord, il est crucial d’éviter de blesser les muscles observés pendant le processus de dissection. Il peut être utile de fixer le filet avant de retirer les organes internes pour éviter tout contact direct entre la pince et les muscles. Pour éviter les lésions musculaires ou la séparation de l’épiderme larv.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilué 1:200
Anti-décoloration amélioré Montage Moyen	Beyotime	P0128M
FV10-ASW Microscope confocal	Olympus
Fluor 488 conjugué	Thermo Fisher	A-11001	dilué 1:1 000
Microscope confocal laser LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Anticorps anti-Futsch	de souris Etudes développementales Hybridoma Bank  ;   ;	22C10	dilué 1:50
Anticorps anti-&alpha ;-tubuline de souris	Sigma	T5168	dilué 1:1 000
Paraformaldéhyde	Wako	168-20955	Concentration finale : 4 % dans le tampon PB
Acier inoxydable Minutien Pins	Entomoravia		0,1 mm Diam
Stéréomicroscope SMZ161	Fluorescence
microscope BX41	Olympus
Texas Chèvre conjuguée rouge anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilué 1:100
TO-PRO(R) 3 iodure	Invitrogen	T3605	dilué 1:1 000
Agitateur décolorant par transfert TS-8	Kylin-Bell instruments de laboratoire	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Pince à épiler	Dumont	500342

Goat anti-souris, Alexa stéréoscopique motique