Methodologie om bacteriën metabolisch te inactiveren voor Caenorhabditis elegans-onderzoek
Summary
De voedselbron voor Caenorhabditis elegans in het lab is levende Escherichia coli. Omdat bacteriën metabolisch actief zijn, vormen ze een verstorende variabele in metabole en geneesmiddelstudies bij C. elegans. Een gedetailleerd protocol om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde wordt hier beschreven.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een veelgebruikt modelorganisme voor onderzoek op het gebied van genetica, ontwikkeling, veroudering, metabolisme en gedrag. Omdat C. elegans een dieet van levende bacteriën consumeert, kan de metabolische activiteit van hun voedselbron experimenten verwarren die op zoek zijn naar de directe effecten van verschillende interventies op de worm. Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme te voorkomen, hebben C. elegans-onderzoekers meerdere methoden gebruikt om bacteriën metabolisch te inactiveren, waaronder ultraviolette (UV)-bestraling, warmtedodend en antibiotica. UV-behandeling heeft een relatief lage doorvoer en kan niet worden gebruikt in vloeibare cultuur omdat elke plaat moet worden onderzocht op succesvolle bacteriële doding. Een tweede behandelingsmethode, hittedodend, heeft een negatieve invloed op de textuur en voedingskwaliteit van de bacteriën, wat leidt tot de ontwikkelingsstop van C. elegans. Ten slotte kan behandeling met antibiotica de fysiologie van C. elegans direct veranderen, naast het voorkomen van bacteriegroei. Dit manuscript beschrijft een alternatieve methode om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde (PFA). PFA-behandeling verknoopt eiwitten in bacteriële cellen om metabolische activiteit te voorkomen met behoud van de celstructuur en voedingswaarde. Deze methode heeft een hoge doorvoer en kan worden gebruikt in vloeibare cultuur of vaste platen, omdat het testen van één plaat met PFA-behandelde bacteriën op groei de hele batch valideert. Metabole inactivatie door middel van PFA-behandeling kan worden gebruikt om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op onderzoeken naar suppletie met geneesmiddelen of metabolieten, stressbestendigheid, metabolomics en gedrag bij C. elegans te elimineren.
Introduction
Caenorhabditis elegans werd oorspronkelijk voorgesteld als een modelorganisme in 19651 en is sindsdien op grote schaal toegepast in studies naar genetica, ontwikkeling, gedrag, veroudering en metabolisme2. Door hun grote broedgrootte en transparante cuticula is C. elegans bijzonder geschikt voor high-throughput screening met fluorescerende reporters3. Hun korte levenscyclus, hermafrodiete voortplanting en genetische homologie met mensen maken C. elegans ook tot een waardevol modelsysteem voor studies over ontwikkeling4 en verouderingsbiologie5. Bovendien zijn C. elegans relatief gemakkelijk te onderhouden. Wormen kunnen worden gekweekt in vloeibare cultuur of op vaste agarplaten en een dieet van levende Escherichia coli OP50-bacteriën consumeren4.
De levende voedselbron van C. elegans kan echter studies naar metabolisme, medicijnsuppletie en gedrag verwarren. Omdat levende bacteriën hun eigen metabolisme hebben, veranderen experimentele omstandigheden die de bacteriën beïnvloeden ook de voedingsstoffen en metabolieten die beschikbaar zijn voor de wormen. Verschillen in bacteriële ijzer-, aminozuur- en foliumzuurconcentraties hebben bijvoorbeeld verschillende effecten op de ontwikkeling, fysiologie en levensduur van C. elegans. Veel gangbare laboratoriumpraktijken kunnen dergelijke veranderingen in de samenstelling van voedingsstoffen en metabolieten die door OP50 worden geproduceerd, veroorzaken. In het bijzonder veroorzaakt blootstelling aan 5-fluor-2′-deoxyuridine (FUdR), een verbinding die vaak wordt gebruikt om reproductie bij C. elegans te voorkomen, brede veranderingen in de genexpressie van OP50, inclusief aminozuurbiosyntheseroutes7. Levende bacteriën kunnen ook studies verwarren waarin C. elegans wordt aangevuld met kleine moleculen, omdat bacteriën de actieve verbindingen gedeeltelijk of volledig kunnen metaboliseren. Bovendien kunnen de effecten van deze kleine moleculen op de bacteriën op hun beurt de fysiologie van C. elegans veranderen, zoals werd gerapporteerd met het levensduurverlengende medicijn metformine8. Ten slotte kunnen levende bacteriën de omgeving van de worm veranderen op manieren die het gedrag veranderen, zoals het afscheiden van aantrekkelijke geurstoffen9, het produceren van exogene neuromodulatoren10 en het creëren van zuurstofgradiënten in een gazon met dichte bacteriën11.
Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op C. elegans-onderzoek te verminderen, zijn meerdere methoden ontwikkeld om bacteriën te doden (tabel 1). Drie veelgebruikte strategieën voor het doden van OP50 zijn UV-bestraling, hittedoding en antibioticabehandeling. Hoewel eenvoudig en relatief goedkoop, kan elk van deze methoden ongewenste effecten hebben op zowel bacteriën als C. elegans. UV-doding via een UV-crosslinker12 heeft een lage doorvoer en de snelheid wordt beperkt door het aantal platen dat in de UV-crosslinker past. Bovendien kan de werkzaamheid van UV-doding variëren van plaat tot plaat binnen een batch, en het testen op groei op alle platen kan moeilijk worden in grote experimenten. Het hittedoden van OP50 door cultuur bloot te stellen aan temperaturen van >60 °C brengt een aparte reeks uitdagingen met zich mee. Hoge hitte kan voedingsstoffen beschadigen die essentieel zijn voor de worm en de celstructuur van bacteriën vernietigen, waardoor een zachtere textuur ontstaat die de hoeveelheid tijd die wormen aan het voedsel besteden, vermindert. Deze methode kan ook niet gedurende de hele levenscyclus van C. elegans worden gebruikt, omdat wormen die door hitte gedode bacteriën krijgen, vroeg in de ontwikkeling kunnen stoppen13. Behandeling met antibiotica is een derde veelgebruikte methode om het bacteriële metabolisme te onderdrukken14, maar antibiotica kunnen ook de groei en het metabolisme van wormen veranderen15.
Een oplossing om de metabolische effecten van levende bacteriën te elimineren met behoud van de bacteriële structuur en essentiële voedingsstoffen, is het doden van OP50 met paraformaldehyde (PFA)16. PFA is een polymeer van formaldehyde dat eiwitten in cellen kan verknopen17 om bacteriële replicatie te voorkomen zonder interne celstructuren zoals het binnenste plasmamembraan te vernietigen18. Vanwege dit behoud van de interne celstructuur vertonen met PFA behandelde bacteriën geen groei of metabolische activiteit, maar blijven ze een eetbare en voedselrijke voedselbron voor C. elegans16. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven dat laat zien hoe bacteriën metabolisch kunnen worden geïnactiveerd met behulp van paraformaldehyde.
| Methode | Benodigde materialen | Schaalbare? | Voeding? | Effecten op worm? | ||||
| UV | UV-crosslinker | Beperkt door: | Ja | Variabele effecten op levensduur op NGM12, 23, 24 | ||||
| Aantal platen dat in UV-crosslinker past | Variabele effecten op de levensduur van FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Bestralingstijd per plaat | Verminderde voedselvoorkeur16 | |||||||
| Mogelijkheid om elke plaat te controleren op groei8 | ||||||||
| Hitte | >60 °C incubator | Ja | Nee: vernietigt celwand, verminderde voedingswaarde | Ontwikkelingsstilstand 13 | ||||
| Verminderde voedselvoorkeur13 | ||||||||
| Verlengt de levensduur van NGM31 | ||||||||
| Antibiotica | Antibiotica (kanamycine, carbenicilline, enz.) | Ja | Ja | Vertraagt groei en ontwikkeling15 | ||||
| Verlengt de levensduur in vloeibare media19 | ||||||||
| Verlengt de levensduur van NGM15 | ||||||||
| PFA (PFA) | 0,5% paraformaldehyde | Ja | Ja | Kleine broedgrootte afname16 | ||||
| Kleine toename van de ontwikkelingstijd16 | ||||||||
| Verminderde voedselvoorkeur16 | ||||||||
Tabel 1. Vergelijkingen van methoden om OP50 te doden. UV-killing, hitte-killing, antibiotica-behandeling en PFA-behandeling hebben verschillende effecten op de voedingsstatus van de bacteriën en de gezondheid van wormen die behandelde bacteriën krijgen. Deze methoden voor het repliceren van E. coli verschillen ook in hun vereiste materialen en schaalbaarheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voordelen van PFA-dodend ten opzichte van andere bacteriedodende methoden
PFA-behandeling is een high-throughput methode om bacterieel metabolisme te voorkomen en tegelijkertijd een voedzame voedselbron voor C. elegans te behouden. Het doden van bacteriën via PFA-behandeling heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere methoden. In tegenstelling tot UV-behandeling, waarbij elke plaat moet worden getest op succesvolle doding, kan een enkele plaat van een batch PFA-behandelde bacteriën wo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH R21AG059117 en de Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research aan de Universiteit van Michigan. SB werd gefinancierd door T32AG000114. ESK werd gefinancierd door NSF DGE 1841052.
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. . Elegans II. 33, (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Génétique. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal’s food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Génétique. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O’Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio – the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
