예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 연구를 위한 대사 불활성화 박테리아 방법론
Summary
실험실에서 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 먹이 공급원은 살아있는 대장균입니다. 박테리아는 대사적으로 활동적이기 때문에 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 대사 및 약물 연구에서 혼란스러운 변수를 제시합니다.파라포름알데히드를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 자세한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 유전학, 발달, 노화, 신진대사 및 행동 연구를 위한 일반적인 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 살아있는 박테리아를 섭취하기 때문에 먹이 공급원의 대사 활동은 벌레에 대한 다양한 개입의 직접적인 효과를 찾는 실험을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구자들은 박테리아 대사의 교란 효과를 피하기 위해 자외선(UV) 조사, 열 사멸 및 항생제를 포함하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 여러 가지 방법을 사용했습니다. UV 처리는 상대적으로 처리량이 낮고 각 플레이트가 성공적인 박테리아 사멸을 검사해야 하기 때문에 액체 배양에 사용할 수 없습니다. 두 번째 치료 방법인 열 살해는 박테리아의 질감과 영양 품질에 부정적인 영향을 미쳐 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 발달 정지를 초래합니다. 마지막으로, 항생제 치료는 박테리아 성장을 막는 것 외에도 예쁜꼬마선충의 생리학을 직접적으로 변화시킬 수 있습니다. 이 원고는 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 대체 방법을 설명합니다. PFA 처리는 박테리아 세포 내에서 단백질을 가교하여 세포 구조와 영양 성분을 보존하면서 대사 활동을 방지합니다. 이 방법은 처리량이 많으며 PFA 처리된 박테리아의 한 플레이트의 성장을 테스트하여 전체 배치를 검증하기 때문에 액체 배양 또는 고체 플레이트에서 사용할 수 있습니다. PFA 처리를 통한 대사 불활성화는 예쁜꼬마선충의 약물 또는 대사 산물 보충, 스트레스 저항성, 대사체학 및 행동에 대한 연구에서 박테리아 대사의 교란 효과를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 1965년에 모델 생물체로 처음제안되었으며1 이후 유전학, 발달, 행동, 노화 및 신진대사 연구에 널리 채택되었다2. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 큰 무리 크기와 투명한 표피 때문에 형광 리포터를 이용한 고처리량 스크리닝에 특히 적합하다3. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 짧은 생애주기, 자웅동체 번식, 인간과의 유전적 상동성(genetic homology)은 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 발달 연구(development biology)4 및 노화 생물학(aging biology)5 연구에 유용한 모델 시스템으로 만든다. 더욱이, 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 비교적 관리하기가 쉽습니다. 웜은 액체 배양 또는 고체 한천 플레이트에서 자랄 수 있으며 살아있는 대장균 OP50 박테리아를 섭취할 수 있다4.
그러나 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 살아있는 먹이 공급원은 신진대사, 약물 보충제 및 행동에 대한 연구를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 살아있는 박테리아는 자체 신진대사를 가지고 있기 때문에 박테리아에 영향을 미치는 실험 조건은 벌레가 사용할 수 있는 영양분과 대사 산물도 변화시킵니다. 예를 들어, 박테리아의 철분, 아미노산, 엽산 농도의 차이는 예쁜꼬마선충의 발달, 생리, 수명에 다양한 영향을 미친다6. 많은 일반적인 실험실 관행은 OP50에 의해 생성되는 영양소 조성 및 대사 산물의 변화를 유도할 수 있습니다. 특히, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 번식을 막기 위해 일반적으로 사용되는 화합물인 5-플루오로-2′-데옥시우리딘(FUdR)에 노출되면 아미노산 생합성 경로를 포함한 OP50 유전자 발현의 광범위한 변화를 유도한다7. 살아있는 박테리아는 또한 박테리아가 활성 화합물을 부분적으로 또는 완전히 대사할 수 있기 때문에 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 작은 분자를 보충하는 연구를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 더욱이, 박테리아에 대한 이러한 작은 분자의 영향은 수명 연장 약물인 메트포르민8로 보고된 바와 같이 예쁜꼬마선충의 생리학을 변화시킬 수 있습니다. 마지막으로, 살아있는 박테리아는 매력적인 냄새 물질9을 분비하고, 외인성 신경 조절제(exogenous neuromodulators)10를 생성하며, 밀집된 박테리아 잔디밭(11)에서 산소 구배를 생성하는 것과 같은 행동을 변화시키는 방식으로 벌레의 환경을 변화시킬 수 있다.
예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구에 대한 박테리아 대사의 교란 효과를 완화하기 위해 박테리아를 죽이는 여러 가지 방법이 개발되었습니다(표 1). OP50을 죽이는 세 가지 일반적인 전략은 자외선 조사, 열 살해 및 항생제 처리입니다. 간단하고 비교적 비용이 저렴하지만 이러한 각 방법은 박테리아와 예쁜꼬마선충 모두에게 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있습니다. UV 가교제(12)를 통한 UV-사멸은 낮은 처리량이며, 그 속도는 UV 가교제에 들어갈 수 있는 플레이트의 수에 의해 제한된다. 또한 UV 사멸의 효능은 배치 내에서 플레이트마다 다를 수 있으며 대규모 실험에서는 모든 플레이트의 성장을 테스트하는 것이 어려울 수 있습니다. 배양액을 >60°C의 온도에 노출시켜 OP50을 열 사멸시키는 데는 별도의 문제가 있습니다. 고열은 지렁이에게 필수적인 영양소를 손상시키고 박테리아의 세포 구조를 파괴하여 지렁이가 음식에 소비하는 시간을 줄이는 부드러운 질감을 만들 수 있습니다13. 이 방법은 또한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 생애 주기 동안 사용할 수 없는데, 그 이유는 열로 죽은 박테리아를 먹인 벌레가 발달 초기에 체포될 수 있기 때문이다13. 항생제 치료는 세균 대사를 억제하는 세 번째 일반적인 방법이지만14 항생제는 기생충의 성장과 신진대사를 변화시킬 수도 있다15.
박테리아 구조와 필수 영양소를 보존하면서 살아있는 박테리아의 대사 효과를 제거하는 한 가지 솔루션은 파라포름알데히드(PFA)로 OP50을 죽이는 것입니다.16 PFA는 포름알데히드의 중합체로서 세포(17) 내의 단백질을 가교시켜 내부 원형질막(18)과 같은 내부 세포 구조를 파괴하지 않고 박테리아 복제를 방지할 수 있다. 이러한 내부 세포 구조의 보존으로 인해, PFA 처리된 박테리아는 성장이나 대사 활동을 나타내지 않지만, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 식용 및 영양이 풍부한 식품 공급원으로 남아 있다 16. 여기에서는 파라포름알데히드를 사용하여 박테리아를 대사적으로 비활성화하는 방법을 보여주는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
| 메서드 | 필수 자료 | 확장성? | 영양? | 웜에 미치는 영향? | ||||
| 자외선 | UV 가교제 | 제한: | 예 | NGM12, 23, 24의 수명에 대한 다양한 영향 | ||||
| UV 가교제에 맞는 플레이트 수 | FUdR24, 26, 27의 수명에 대한 다양한 영향 | |||||||
| 플레이트당 조사 시간 | 음식 선호도 감소16 | |||||||
| 모든 접시의 성장을 확인하는 능력8 | ||||||||
| 열 | >60 °C 인큐베이터 | 예 | 아니오 : 세포벽을 파괴하고 영양가를 감소시킵니다. | 발달 정지 13 | ||||
| 음식 선호도 감소13 | ||||||||
| NGM31의 수명 연장 | ||||||||
| 항생제 | 항생제(카나마이신, 카베니실린 등) | 예 | 예 | 성장과 발전 지연15 | ||||
| 액체 매질의 수명 연장19 | ||||||||
| NGM15의 수명 연장 | ||||||||
| PFA (PFA) | 0.5% 파라포름알데히드 | 예 | 예 | 작은 무리 크기 감소16 | ||||
| 작은 개발 시간 증가16 | ||||||||
| 음식 선호도 감소16 | ||||||||
표 1. OP50을 죽이는 방법 비교. 자외선 사멸, 열 사멸, 항생제 처리 및 PFA 처리는 박테리아의 영양 상태와 처리된 박테리아를 먹인 벌레의 건강에 다양한 영향을 미칩니다. 대장균 을 복제적으로 비활성화하는 이러한 방법은 필요한 재료와 확장성도 다릅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 박테리아 살상 방법과 비교되는 PFA 살상의 이점
PFA 처리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 영양가 있는 식품 공급원을 유지하면서 박테리아 대사를 방지하는 고처리량 방법입니다. PFA 처리를 통해 박테리아를 죽이는 것은 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성공적인 사멸을 위해 모든 플레이트를 테스트해야 하는 UV 처리와 달리, PFA 처리된 박테리아 배치의 단일 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH R21AG059117와 미시간 대학의 노화 연구 생물학을 위한 Paul F. Glenn Laboratories의 자금 지원을 받았습니다. SB는 T32AG000114에서 자금을 지원했습니다. ESK는 NSF DGE 1841052에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. . Elegans II. 33, (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Génétique. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal’s food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Génétique. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O’Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio – the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
