Les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes peuvent être purifiés par tri cellulaire, en utilisant une combinaison de coloration de la molécule d’adhésion des cellules leucocytaires activées (ALCAM, également connue sous le nom de CD166).
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Article de méthode
Application de la coloration des mitochondries vivantes dans le tri cellulaire pour purifier les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches embryonnaires humaines (SE) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) ont des applications potentielles en médecine régénérative cellulaire pour traiter les organes gravement malades en raison de leur prolifération illimitée et de leurs propriétés pluripotentes. Cependant, il est difficile de différencier les cellules ES/iPS humaines en types de cellules cibles 100 % pures en raison de leur grande sensibilité à l’environnement. La tumorigenèse après transplantation est causée par des cellules contaminées, proliférantes et indifférenciées, ce qui rend la technologie de haute purification essentielle pour la réalisation en toute sécurité de la médecine régénérative. Pour atténuer le risque de tumorigenèse, une technologie de purification élevée a été développée pour les hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines. La méthode utilise le FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) en utilisant une combinaison de contenu mitochondrial élevé et du marqueur de surface cellulaire ALCAM (molécule d’adhésion cellulaire leucocytaire activée) sans modification génétique. 97 % ± 0,38 % (n = 5) des hépatocytes purifiés utilisant cette méthode présentaient une expression protéique de l’albumine. Cet article vise à fournir des procédures détaillées pour cette méthode, telle qu’appliquée à la méthode de différenciation bidimensionnelle la plus récente pour les cellules iPS humaines en hépatocytes.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires et pluripotentes induites (ES et iPS, respectivement) sont considérées comme des sources cellulaires prometteuses pour les thérapies régénératives. Cependant, l’efficacité de la différenciation de ces cellules en types de cellules cibles spécifiques peut varier, même en utilisant la même lignée cellulaire, le même protocole et le même expérimentateur 1,2,3,4. Cette variabilité peut être attribuée à la grande sensibilité des cellules ES/iPS humaines à leur environnement. Par conséquent, il est actuellement ....
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Protocole
Cette étude a utilisé des cellules iPS humaines obtenues commercialement (souche 253G1) (voir le tableau des matériaux).
1. Maintenance des cellules iPS humaines
- Maintenir les cellules iPS humaines dans des conditions exemptes de feeder dans un milieu AK02 sur des boîtes de culture recouvertes de 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (voir le tableau des matériaux).
2. Différenciation hépatique des cellules iPS humaines dans des cultures 2D
REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1A
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Résultats
La chronologie des processus induisant les cellules iPS humaines à se différencier en hépatocytes par culture 2D (Figure 1A) et les caractéristiques cellulaires représentatives (Figure 1B) sont présentées. Approximativement au 12e jour de différenciation, les cellules ont commencé à présenter des formes cellulaires polygonales et des noyaux ronds, caractéristiques des hépatocytes. Certains hépatocytes ont également montré une multinucléation.
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Discussion
En raison de leurs fonctions dans le métabolisme des nutriments et la détoxification, les hépatocytes possèdent un nombre relativement important de mitochondries par rapport aux autres types de cellules15. ALCAM fait partie de la superfamille des immunoglobulines et joue un rôle dans l’adhésion et la migration cellulaires. Il est exprimé dans divers types de cellules, notamment les cellules hépatiques, épithéliales, lymphoïdes, myéloïdes, fibroblastiques et neuronales16. En.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie n° de subvention [23390072].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 253G1 lignée cellulaire humaine iPS | recherche RIKEN BioResource | HPS0002 | |
| 4 % de paraformaldéhyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
| Activine A Solution, humaine, recombinante | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
| Anticorps anti-noyaux, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | contre l’antigène nucléaire humain |
| B-27 Supplément (50x), sans sérum | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | Trieur de cellules | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 ; | |
| Ciclosporine A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
| Collagénase | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
| Corning Matrigel Facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basale | Corning | 354230 | Matrice de membrane basale de type gel |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | Inhibiteur de ROCK |
| Dexaméthasone | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
| Anticorps secondaire anti-chèvre IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 488 Thermo | Fisher Scientific | A-11055 | |
| Anticorps secondaire anti-souris Donkey (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546 Thermo | Fisher Scientific | A10036 | |
| IgG anti-lapin Donkey (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 488 Thermo | Fisher Scientific | A-21206 | |
| Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre cellulaire Snap Cap | Corning | 352235 | |
| sérum | de bovin fœtalBiowest | 51820-500 | |
| Supplément GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine |
| Humain/Souris/Rat/Canin ALCAM/CD166 Anticorps | R& D Systems | AF1172 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sel sodique | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 soie | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | Solution bloquante |
| ITS-G Supplement(× ; 100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
| N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin | Dako | A0001 | |
| Polyoxyéthylène Sorbitan Monolaurate (préadolescent de 20 ans) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
| L-ascorbate de sodium | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
| Tétraméthylrhodamine, ester méthylique (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
| Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
| Trypan Blue Solution | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
| TRYPSINE 250 | Difco | 215240 | |
| Solution de bouillon de phosphate de tryptose | Sigma-Aldrich | T8159 |
Références
- Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
- Laco, F., et al.
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Réimpressions et autorisations
