Computergestütztes Analyse-Tutorial für chimäre kleine nichtkodierende RNA: Ziel-RNA-Sequenzierungsbibliotheken
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Installation und Verwendung einer bioinformatischen Pipeline zur Analyse chimärer RNA-Sequenzierungsdaten demonstriert, die bei der Untersuchung von in vivo RNA:RNA-Interaktionen verwendet werden.
Abstract
Das Verständnis der in vivo genregulatorischen Wechselwirkungen von kleinen nicht-kodierenden RNAs (sncRNAs), wie z.B. microRNAs (miRNAs), mit ihren Ziel-RNAs wurde in den letzten Jahren durch biochemische Ansätze verbessert, die Cross-Linking gefolgt von Ligation verwenden, um sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen durch die Bildung chimärer RNAs und anschließende Sequenzierungsbibliotheken zu erfassen. Während Datensätze aus der chimären RNA-Sequenzierung genomweite und wesentlich weniger mehrdeutige Eingaben liefern als miRNA-Vorhersagesoftware, erfordert die Destillation dieser Daten in aussagekräftige und umsetzbare Informationen zusätzliche Analysen und kann Forscher ohne rechnerischen Hintergrund davon abhalten. Dieser Bericht enthält ein Tutorial zur Unterstützung von Bioinformatikern auf Einstiegsebene bei der Installation und Anwendung eines aktuellen Open-Source-Software-Tools: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Plattformanforderungen, Updates und eine Erläuterung der Pipelineschritte und der Manipulation der wichtigsten Benutzereingabevariablen werden bereitgestellt. Der Abbau einer Barriere für Biologen, um Erkenntnisse aus chimären RNA-Sequenzierungsansätzen zu gewinnen, hat das Potenzial, entdeckungsbasierte Untersuchungen von regulatorischen sncRNA-Ziel-RNA-Interaktionen in verschiedenen biologischen Kontexten in Gang zu bringen.
Introduction
Kleine nicht-kodierende RNAs werden intensiv auf ihre posttranskriptionelle Rolle bei der Koordination der Expression von Genen in verschiedenen Prozessen wie Differenzierung und Entwicklung, Signalverarbeitung und Krankheit untersucht 1,2,3. Die Fähigkeit, die Zieltranskripte von genregulatorischen kleinen nichtkodierenden RNAs (sncRNAs), einschließlich microRNAs (miRNAs), genau zu bestimmen, ist für Studien der RNA-Biologie sowohl auf grundlegender als auch auf translationaler Ebene von Bedeutung. Bioinformatische Algorithmen, die die erwartete Komplementarität zwischen der miRNA-Seed-Sequenz und ihren potenziellen Zielen ausnutzen, werden häufig für die Vorhersage von miRNA-Ziel-RNA-Interaktionen verwendet. Obwohl diese bioinformatischen Algorithmen erfolgreich waren, können sie sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Ergebnisse enthalten, wie an anderer Stelle überprüft wurde 4,5,6. In jüngster Zeit wurden mehrere biochemische Ansätze entwickelt und implementiert, die eine eindeutige und semiquantitative Bestimmung von in vivo sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen durch In-vivo-Vernetzung und anschließende Einbeziehung eines Ligationsschritts ermöglichen, um die sncRNA physisch an ihr Ziel zu binden, um eine einzelne chimäre RNA zu bilden 4,5,7,8,9,10 . Die anschließende Präparation von Sequenzierungsbibliotheken aus den chimären RNAs ermöglicht die Bewertung der sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen durch computergestützte Verarbeitung der Sequenzierungsdaten. Dieses Video enthält ein Tutorial für die Installation und Verwendung einer Rechenpipeline, die als kleine chimäre RNA-Analyse-Pipeline (SCRAP) bezeichnet wird und eine robuste und reproduzierbare Analyse von sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen aus chimären RNA-Sequenzierungsbibliotheken ermöglicht6.
Ein Ziel dieses Tutorials ist es, Forscher dabei zu unterstützen, sich nicht übermäßig auf rein prädiktive bioinformatische Algorithmen zu verlassen, indem die Barrieren für die Analyse von Daten gesenkt werden, die durch biochemische Ansätze generiert werden, die chimäre molekulare Auslesungen von sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen liefern. Dieses Tutorial enthält praktische Schritte und Tipps, um angehende Computerwissenschaftler durch die Verwendung einer Pipeline, SCRAP, zu führen, die für die Analyse chimärer RNA-Sequenzierungsdaten entwickelt wurde, die durch mehrere bestehende biochemische Protokolle generiert werden können, einschließlich Crosslinking, Ligation und Sequenzierung von Hybriden (CLASH) und kovalenter Ligation endogener Argonaute-gebundener RNAs – Crosslinking und Immunpräzipitation (CLEAR-CLIP)7,9.
Die Verwendung von SCRAP bietet mehrere Vorteile für die Analyse von chimären RNA-Sequenzierungsdaten im Vergleich zu anderen Rechenpipelines6. Ein herausragender Vorteil ist die umfangreiche Annotation und die Integration von Call-Outs zu gut unterstützten und routinemäßig aktualisierten bioinformatischen Skripten innerhalb der Pipeline im Vergleich zu alternativen Pipelines, die häufig auf benutzerdefinierten und/oder nicht unterstützten Skripten für Schritte in der Pipeline angewiesen sind. Diese Funktion verleiht SCRAP Stabilität und macht es für Forscher lohnenswerter, sich mit der Pipeline vertraut zu machen und deren Einsatz in ihren Arbeitsablauf zu integrieren. Es wurde auch gezeigt, dass SCRAP alternative Pipelines bei der Aufrufung von Peaks von sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen übertrifft und plattformübergreifende Funktionalität aufweist, wie in einer früheren Veröffentlichungbeschrieben 6.
Am Ende dieses Tutorials werden Benutzer in der Lage sein, (i) die Plattformanforderungen für SCRAP zu kennen und SCRAP-Pipelines zu installieren, (ii) Referenzgenome zu installieren und Befehlszeilenparameter für SCRAP einzurichten und (iii) die Kriterien für Peak-Aufrufe zu verstehen und Peak-Aufrufe und Peak-Annotationen durchzuführen.
In diesem Video wird im praktischen Detail beschrieben, wie Forscher, die sich mit RNA-Biologie befassen, die Rechenpipeline SCRAP installieren und optimal nutzen können, um sncRNA-Interaktionen mit Ziel-RNAs, wie z. B. Boten-RNAs, in chimären RNA-Sequenzierungsdaten zu analysieren, die durch einen der diskutierten biochemischen Ansätze zur Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken gewonnen wurden.
SCRAP ist ein Befehlszeilenprogramm. Im Allgemeinen muss der Benutzer gemäß der folgenden Anleitung (i) SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) herunterladen und installieren, (ii) Referenzgenome installieren und SCRAP ausführen und (iii) Peak-Aufrufe und -Annotationen durchführen.
Weitere Details zu den Berechnungsschritten in diesem Verfahren finden Sie unter https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. Dieser Artikel enthält die Einrichtung und Hintergrundinformationen, die es Forschern mit Einstiegskenntnissen ermöglichen, SCRAP in chimären RNA-Sequenzierungsbibliotheksdatensätzen zu installieren, zu optimieren und zu verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll über die Verwendung der SCRAP-Pipeline für die Analyse von sncRNA:Ziel-RNA-Interaktionen wurde entwickelt, um Forscher zu unterstützen, die in die computergestützte Analyse einsteigen. Es wird erwartet, dass der Abschluss des Tutorials Forscher mit Einstiegs- oder größerer Computererfahrung durch die Schritte führt, die für die Installation und Verwendung dieser Pipeline und ihrer Anwendung zur Analyse von Daten aus chimären RNA-Sequenzierungsbibliotheken erforderlich sind. Zu den Schritten, die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Meffert-Labors für hilfreiche Gespräche, darunter BH Powell und WT Mills IV, für ihr kritisches Feedback zur Beschreibung der Installation und Implementierung der Pipeline. Diese Arbeit wurde durch einen Preis der Braude Foundation, das Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, den Blaustein Endowment for Pain Research and Education Award und NINDS RO1NS103974 und NIMH RO1MH129292 an M.K.M. unterstützt.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
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