מדריך לניתוח חישובי עבור Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים התקנה ושימוש בצנרת ביואינפורמטיקה לניתוח נתוני ריצוף RNA כימריים המשמשים במחקר אינטראקציות in vivo RNA:RNA.
Abstract
הבנה של אינטראקציות הבקרה של גנים in vivo של רנ”א קטן שאינו מקודד (sncRNAs), כגון מיקרו-רנ”א (miRNAs), עם רנ”א המטרה שלהם קודמה בשנים האחרונות על ידי גישות ביוכימיות המשתמשות בקישור צולב ואחריו קשירה כדי ללכוד אינטראקציות sncRNA:מטרת RNA באמצעות יצירת RNA כימרי וספריות ריצוף עוקבות. בעוד שמערכי נתונים מריצוף RNA כימרי מספקים קלט כלל גנומי והרבה פחות מעורפל מאשר תוכנת חיזוי miRNA, זיקוק נתונים אלה למידע משמעותי ובר ביצוע דורש ניתוחים נוספים ועשוי להניא חוקרים חסרי רקע חישובי. דוח זה מספק ערכת לימוד לתמיכה בביולוגים חישוביים ברמה התחלתית בהתקנה ויישום של כלי תוכנה עדכני בקוד פתוח: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). דרישות פלטפורמה, עדכונים והסבר על שלבי צינור ומניפולציה של משתני קלט משתמש מרכזיים מסופקים. הפחתת מחסום עבור ביולוגים כדי לקבל תובנות מגישות ריצוף RNA כימרי יש פוטנציאל קרש קפיצה חקירות מבוססות גילוי של sncRNA רגולטורי: אינטראקציות RNA מטרה בהקשרים ביולוגיים מרובים.
Introduction
רנ”א קטן שאינו מקודד נחקר רבות בשל תפקידיו שלאחר השעתוק בתיאום ביטוי מחבילות גנים בתהליכים מגוונים כגון התמיינות והתפתחות, עיבוד אותות ומחלות 1,2,3. היכולת לקבוע במדויק את תעתיקי המטרה של RNA קטן שאינו מקודד (sncRNAs), כולל מיקרו-רנ”א (miRNAs), היא בעלת חשיבות למחקרים של ביולוגיה של RNA הן ברמה הבסיסית והן ברמת התרגום. אלגוריתמים ביואינפורמטיים המנצלים את המשלימות הצפויה בין רצף זרעי ה-miRNA לבין המטרות הפוטנציאליות שלו שימשו לעתים קרובות לחיזוי אינטראקציות miRNA:target RNA. בעוד אלגוריתמים ביואינפורמטיים אלה הצליחו, הם יכולים גם להכיל תוצאות חיוביות כוזבות ושליליות כוזבות, כפי שנסקר במקומות אחרים 4,5,6. לאחרונה, מספר גישות ביוכימיות תוכננו ויושמו המאפשרות קביעה חד משמעית וכמותית למחצה של אינטראקציות de vivo sncRNA:target RNA על ידי הצלבה in vivo ושילוב של שלב קשירה לחיבור פיזי של sncRNA למטרה שלו ליצירת RNA כימרי יחיד 4,5,7,8,9,10 . הכנה עוקבת של ספריות ריצוף מהרנ”א הכימרי מאפשרת הערכה של אינטראקציות sncRNA:target RNA על ידי עיבוד חישובי של נתוני הריצוף. סרטון וידאו זה מספק הדרכה להתקנה ושימוש בצנרת חישובית המכונה Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP), אשר נועדה לאפשר ניתוח חזק וניתן לשחזור של sncRNA:אינטראקציות RNA מטרה מספריות ריצוף RNA כימריות6.
מטרת מדריך זה היא לסייע לחוקרים להימנע מהסתמכות מוגזמת על אלגוריתמים ביואינפורמטיים מנבאים גרידא על ידי הורדת מחסומים לניתוח נתונים המופקים באמצעות גישות ביוכימיות המספקות קריאות מולקולריות כימריות של אינטראקציות sncRNA:target RNA. מדריך זה מספק צעדים מעשיים וטיפים להנחיית מדענים חישוביים ברמה התחלתית באמצעות שימוש בצנרת, SCRAP, שפותחה לניתוח נתוני ריצוף RNA כימריים, אשר ניתן להפיק על ידי מספר פרוטוקולים ביוכימיים קיימים, כולל crosslinking, קשירה, וריצוף של היברידים (CLASH) וקשירה קוולנטית של RNA אנדוגני הקשור לארגונאוט – crosslinking ומשקעים חיסוניים (CLEAR-CLIP)7,9.
השימוש בגרוטאות מציע מספר יתרונות לניתוח נתוני ריצוף RNA כימריים, בהשוואה לצנרת חישובית אחרת6. יתרון בולט אחד הוא הביאור הנרחב שלה ושילוב של קריאות לסקריפטים ביואינפורמטיים נתמכים היטב ומתעדכנים באופן שגרתי בתוך הצינור, בהשוואה לצינורות חלופיים שלעתים קרובות מסתמכים על סקריפטים מותאמים אישית ו / או לא נתמכים עבור שלבים בצנרת. תכונה זו מעניקה יציבות לגרוטאות, מה שהופך את זה לכדאי יותר עבור חוקרים להכיר את הצינור ולשלב את השימוש בו בזרימת העבודה שלהם. SCRAP הוכח גם כעולה בביצועיו על צינורות חלופיים בקריאת שיאים של אינטראקציות sncRNA:target RNA ושיש לו פונקציונליות חוצת פלטפורמות, כמפורט בפרסום קודם6.
בסוף ערכת לימוד זו, המשתמשים יוכלו (i) לדעת את דרישות הפלטפורמה עבור SCRAP ולהתקין צינורות SCRAP, (ii) להתקין גנומי ייחוס ולהגדיר פרמטרים של שורת פקודה עבור SCRAP, וכן (iii) להבין קריטריונים של שיחות שיא ולבצע קריטריוני שיא וביאור שיא.
סרטון זה יתאר בפירוט מעשי כיצד חוקרים החוקרים ביולוגיה של רנ”א עשויים להתקין ולהשתמש באופן אופטימלי בצנרת החישובית, SCRAP, כדי לנתח אינטראקציות sncRNA עם רנ”א מטרה, כגון רנ”א שליח, בנתוני ריצוף RNA כימריים המתקבלים באמצעות אחת הגישות הביוכימיות הנדונות להכנת ספריית ריצוף.
SCRAP הוא כלי שורת פקודה. באופן כללי, בהתאם למדריך שלהלן, המשתמש יצטרך (i) להוריד ולהתקין SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) להתקין גנומי ייחוס ולהריץ SCRAP, וכן (iii) לבצע קריאות שיא וביאור.
פרטים נוספים על השלבים החישוביים בהליך זה ניתן למצוא בכתובת https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. מאמר זה יספק את ההגדרה ואת מידע הרקע כדי לאפשר לחוקרים עם מיומנויות חישוביות ברמה התחלתית להתקין, לייעל ולהשתמש בגרוטאות על ערכות נתונים של ספריית ריצוף RNA כימרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה על השימוש בצנרת SCRAP לניתוח אינטראקציות sncRNA:target RNA נועד לסייע לחוקרים הנכנסים לניתוח חישובי. השלמת המדריך צפויה להנחות חוקרים בעלי ניסיון חישובי ברמה התחלתית ומעלה בשלבים הנדרשים להתקנה ושימוש בצנרת זו ויישומה לניתוח נתונים המתקבלים מספריות ריצוף RNA כימריות. השלבים הקריטיים ל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת Meffert על דיונים מועילים, כולל BH Powell ו- WT Mills IV, על משוב קריטי על תיאור ההתקנה והיישום של הצינור. עבודה זו נתמכה על ידי פרס קרן בראודה, תוכנית ההשקה של קרן המחקר של תאי גזע במרילנד, פרס קרן בלאושטיין לחקר כאב וחינוך, ו- NINDS RO1NS103974 ו- NIMH RO1MH129292 ל- M.K.M.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
- Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
- Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
- Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
- Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
- Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
- Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
- Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).
