Opplæring i beregningsanalyse for kimært lite ikke-kodende RNA: Mål-RNA-sekvenseringsbiblioteker
Summary
Her presenterer vi en protokoll som demonstrerer installasjon og bruk av en bioinformatikkrørledning for å analysere kimære RNA-sekvenseringsdata som brukes i studiet av in vivo RNA: RNA-interaksjoner.
Abstract
En forståelse av in vivo-genregulatoriske interaksjoner av små ikke-kodende RNA (sncRNAer), som mikroRNA (miRNA), med deres mål-RNAer, har blitt avansert de siste årene av biokjemiske tilnærminger som bruker kryssbinding etterfulgt av ligering for å fange sncRNA: mål-RNA-interaksjoner gjennom dannelse av kimære RNA og påfølgende sekvenseringsbiblioteker. Mens datasett fra kimær RNA-sekvensering gir genom-bred og vesentlig mindre tvetydig inngang enn miRNA-prediksjonsprogramvare, krever destillasjon av disse dataene til meningsfull og handlingsbar informasjon ytterligere analyser og kan fraråde etterforskere som mangler en beregningsbakgrunn. Denne rapporten gir en veiledning for å støtte beregningsbiologer på inngangsnivå i å installere og bruke et nylig programvareverktøy med åpen kildekode: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Plattformkrav, oppdateringer og en forklaring av pipeline-trinn og manipulering av viktige brukerinngangsvariabler er gitt. Å redusere en barriere for biologer for å få innsikt fra kimære RNA-sekvenseringstilnærminger har potensial til å springbrett oppdagelsesbaserte undersøkelser av regulatoriske sncRNA: mål-RNA-interaksjoner i flere biologiske sammenhenger.
Introduction
Små ikke-kodende RNA er høyt studert for deres post-transkripsjonelle roller i koordinering av uttrykk fra suiter av gener i ulike prosesser som differensiering og utvikling, signalbehandling og sykdom 1,2,3. Evnen til nøyaktig å bestemme måltranskripsjonene av genregulerende små ikke-kodende RNA (sncRNAer), inkludert mikroRNA (miRNA), er av betydning for studier av RNA-biologi både på grunnleggende og translasjonsnivå. Bioinformatiske algoritmer som utnytter forventet komplementaritet mellom miRNA-frøsekvensen og dens potensielle mål, har ofte blitt brukt til prediksjon av miRNA: mål-RNA-interaksjoner. Selv om disse bioinformatiske algoritmene har vært vellykkede, kan de også ha både falske positive og falske negative resultater, som det har blitt gjennomgått andre steder 4,5,6. Nylig har flere biokjemiske tilnærminger blitt designet og implementert som tillater entydig og semikvantitativ bestemmelse av in vivo sncRNA: mål-RNA-interaksjoner ved in vivo tverrbinding og påfølgende inkorporering av et ligeringstrinn for fysisk å feste sncRNA til målet for å danne et enkelt kimært RNA 4,5,7,8,9,10 . Etterfølgende forberedelse av sekvenseringsbiblioteker fra de kimære RNAene tillater vurdering av sncRNA: mål-RNA-interaksjoner ved beregningsbehandling av sekvenseringsdataene. Denne videoen gir en veiledning for installasjon og bruk av en beregningsrørledning kalt liten kimær RNA-analyserørledning (SCRAP), som er designet for å tillate robust og reproduserbar analyse av sncRNA: mål-RNA-interaksjoner fra kimære RNA-sekvenseringsbiblioteker6.
Et mål med denne opplæringen er å hjelpe etterforskere med å unngå overdreven avhengighet av rent prediktive bioinformatiske algoritmer ved å senke barrierer for analyse av data generert gjennom biokjemiske tilnærminger som gir kimære molekylære avlesninger av sncRNA: mål-RNA-interaksjoner. Denne opplæringen gir praktiske trinn og tips for å veilede beregningsforskere på inngangsnivå gjennom bruk av en rørledning, SCRAP, utviklet for å analysere kimære RNA-sekvenseringsdata, som kan genereres av flere eksisterende biokjemiske protokoller, inkludert kryssbinding, ligering og sekvensering av hybrider (CLASH) og kovalent ligering av endogene Argonaute-bundne RNAer – tverrbinding og immunutfelling (CLEAR-CLIP) 7,9.
Bruken av SCRAP gir flere fordeler for analyse av kimære RNA-sekvenseringsdata, sammenlignet med andre beregningsrørledninger6. En fremtredende fordel er dens omfattende merknader og inkorporering av utrop til godt støttede og rutinemessig oppdaterte bioinformatiske skript i rørledningen, sammenlignet med alternative rørledninger som ofte er avhengige av tilpassede og / eller ikke-støttede skript for trinn i rørledningen. Denne funksjonen gir stabilitet til SCRAP, noe som gjør det mer verdt for forskere å gjøre seg kjent med rørledningen og å innlemme bruken i arbeidsflyten. SCRAP har også vist seg å overgå alternative rørledninger ved å kalle topper av sncRNA: mål-RNA-interaksjoner og å ha funksjonalitet på tvers av plattformer, som beskrevet i en tidligere publikasjon6.
Ved slutten av denne opplæringen vil brukerne kunne (i) kjenne plattformkrav for SCRAP og installere SCRAP-rørledninger, (ii) installere referansegenomer og sette opp kommandolinjeparametere for SCRAP, og (iii) forstå toppanropskriterier og utføre toppanrop og toppmerknad.
Denne videoen vil beskrive i praktisk detalj hvordan forskere som studerer RNA-biologi kan installere og optimalt bruke beregningsrørledningen, SCRAP, for å analysere sncRNA-interaksjoner med mål-RNAer, for eksempel messenger-RNAer, i kimære RNA-sekvenseringsdata oppnådd gjennom en av de diskuterte biokjemiske tilnærmingene til sekvensering av bibliotekforberedelse.
SCRAP er et kommandolinjeverktøy. Generelt, etter veiledningen nedenfor, må brukeren (i) laste ned og installere SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) installere referansegenomer og kjøre SCRAP, og (iii) utføre toppanrop og merknad.
Du finner mer informasjon om beregningstrinnene i denne prosedyren på https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. Denne artikkelen vil gi oppsett og bakgrunnsinformasjon for å tillate etterforskere med beregningsferdigheter på inngangsnivå å installere, optimalisere og bruke SCRAP på kimære RNA-sekvenseringsbibliotekdatasett.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen om bruk av SCRAP-rørledning for analyse av sncRNA: mål-RNA-interaksjoner er utformet for å hjelpe etterforskere som inngår beregningsanalyse. Fullføring av opplæringen forventes å veilede etterforskere med beregningserfaring på inngangsnivå eller større beregningserfaring gjennom trinnene som kreves for installasjon og bruk av denne rørledningen og dens applikasjon for å analysere data oppnådd fra kimære RNA-sekvenseringsbiblioteker. Trinn som er kritiske for fullføring av denne protokoll…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Meffert-laboratoriet for nyttige diskusjoner, inkludert BH Powell og WT Mills IV, for kritiske tilbakemeldinger om å beskrive installasjonen og implementeringen av rørledningen. Dette arbeidet ble støttet av en Braude Foundation-pris, Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, Blaustein Endowment for Pain Research and Education-prisen, og NINDS RO1NS103974 og NIMH RO1MH129292 til MKM.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
- Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
- Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
- Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
- Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
- Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
- Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
- Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).
