Tutorial de Análise Computacional para RNA Não-Codificante Pequeno Quimérico: Bibliotecas de Sequenciamento de RNA Alvo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando a instalação e o uso de um pipeline de bioinformática para analisar dados de sequenciamento de RNA quimérico usados no estudo de interações RNA:RNA in vivo .
Abstract
A compreensão das interações regulatórias gênicas in vivo de pequenos RNAs não codificadores (sncRNAs), tais como microRNAs (miRNAs), com seus RNAs-alvo, tem sido avançada nos últimos anos por abordagens bioquímicas que usam ligações cruzadas seguidas de ligadura para capturar interações sncRNA:RNA-alvo através da formação de RNAs quiméricos e bibliotecas de sequenciamento subsequentes. Embora os conjuntos de dados do sequenciamento de RNA quimérico forneçam entrada genômica ampla e substancialmente menos ambígua do que o software de previsão de miRNA, destilar esses dados em informações significativas e acionáveis requer análises adicionais e pode dissuadir os investigadores que não têm conhecimento computacional. Este relatório fornece um tutorial para apoiar biólogos computacionais de nível básico na instalação e aplicação de uma ferramenta de software de código aberto recente: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Requisitos da plataforma, atualizações e uma explicação das etapas do pipeline e manipulação das principais variáveis de entrada do usuário são fornecidas. Reduzir uma barreira para os biólogos obterem insights de abordagens de sequenciamento de RNA quimérico tem o potencial de impulsionar investigações baseadas em descobertas de interações regulatórias de RNA-alvo em múltiplos contextos biológicos.
Introduction
Pequenos RNAs não-codificantes são altamente estudados por seu papel pós-transcricional na coordenação da expressão de conjuntos de genes em diversos processos, como diferenciação e desenvolvimento, processamento de sinais edoenças1,2,3. A capacidade de determinar com precisão os transcritos alvo de pequenos RNAs não codificadores (sncRNAs) reguladores de genes, incluindo microRNAs (miRNAs), é de importância para estudos de biologia de RNA em níveis básicos e translacionais. Algoritmos de bioinformática que exploram a complementaridade antecipada entre a sequência de sementes de miRNA e seus alvos potenciais têm sido frequentemente usados para a predição de interações miRNA:RNA-alvo. Embora esses algoritmos de bioinformática tenham sido bem-sucedidos, eles também podem abrigar resultados falsos positivos e falsos negativos, como já foi revisado em outrosestudos4,5,6. Recentemente, várias abordagens bioquímicas têm sido projetadas e implementadas que permitem a determinação inequívoca e semiquantitativa de interações de vivo sncRNA:RNA-alvo por meio de reticulação in vivo e subsequente incorporação de uma etapa de ligadura para fixar fisicamente o sncRNA ao seu alvo para formar um único RNA quimérico 4,5,7,8,9,10 . A preparação subsequente de bibliotecas de sequenciamento a partir dos RNAs quiméricos permite a avaliação das interações sncRNA:RNA-alvo por processamento computacional dos dados de sequenciamento. Este vídeo fornece um tutorial para instalar e usar um pipeline computacional denominado pipeline de análise de RNA quimérico pequeno (SCRAP), que é projetado para permitir a análise robusta e reprodutível de interações sncRNA:RNA alvo a partir de bibliotecas de sequenciamento de RNA quimérico6.
Um objetivo deste tutorial é ajudar os investigadores a evitar a dependência excessiva de algoritmos de bioinformática puramente preditivos, reduzindo as barreiras para a análise de dados gerados através de abordagens bioquímicas fornecendo leituras moleculares quiméricas de interações sncRNA:RNA-alvo. Este tutorial fornece passos práticos e dicas para orientar cientistas computacionais de nível básico através do uso de um pipeline, o SCRAP, desenvolvido para analisar dados de sequenciamento de RNA quimérico, que podem ser gerados por vários protocolos bioquímicos existentes, incluindo reticulação, ligadura e sequenciamento de híbridos (CLASH) e ligadura covalente de RNAs endógenos ligados a Argonauta- crosslinking e imunoprecipitação (CLEAR-CLIP)7,9.
O uso do SCRAP oferece diversas vantagens para a análise de dados de sequenciamento de RNA quimérico, comparado a outros pipelinescomputacionais6. Uma vantagem importante é sua extensa anotação e a incorporação de chamadas a scripts de bioinformática bem suportados e atualizados rotineiramente dentro do pipeline, em comparação com pipelines alternativos que geralmente dependem de scripts personalizados e/ou não suportados para etapas no pipeline. Esse recurso confere estabilidade ao SCRAP, tornando mais valioso para os pesquisadores se familiarizarem com o pipeline e incorporarem seu uso em seu fluxo de trabalho. O SCRAP também demonstrou superar pipelines alternativos na chamada de picos de interações sncRNA:target RNA e ter funcionalidade de plataforma cruzada, conforme detalhado em uma publicação anterior6.
Ao final deste tutorial, os usuários serão capazes de (i) conhecer os requisitos da plataforma para SCRAP e instalar pipelines SCRAP, (ii) instalar genomas de referência e configurar parâmetros de linha de comando para SCRAP, e (iii) entender os critérios de chamada de pico e executar chamadas de pico e anotação de pico.
Este vídeo descreverá em detalhes práticos como os pesquisadores que estudam a biologia do RNA podem instalar e usar de forma otimizada o pipeline computacional, SCRAP, para analisar as interações do sncRNA com RNAs alvo, tais como RNAs mensageiros, em dados de sequenciamento de RNA quiméricos obtidos através de uma das abordagens bioquímicas discutidas para a preparação da biblioteca de sequenciamento.
SCRAP é um utilitário de linha de comando. Geralmente, seguindo o guia abaixo, o usuário precisará (i) baixar e instalar o SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) instalar genomas de referência e executar o SCRAP, e (iii) realizar chamadas e anotações de pico.
Mais detalhes das etapas computacionais deste procedimento podem ser encontrados em https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. Este artigo fornecerá a configuração e as informações básicas para permitir que investigadores com habilidades computacionais de nível básico instalem, otimizem e usem o SCRAP em conjuntos de dados de bibliotecas de sequenciamento de RNA quimérico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo sobre o uso de pipeline SCRAP para análise de interações sncRNA:RNA alvo é projetado para auxiliar os investigadores que estão entrando em análise computacional. Espera-se que a conclusão do tutorial oriente os investigadores com experiência computacional de nível básico ou superior através das etapas necessárias para a instalação e uso deste pipeline e sua aplicação para analisar dados obtidos de bibliotecas de sequenciamento de RNA quimérico. As etapas críticas para a conclusão deste p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório Meffert pelas discussões úteis, incluindo BH Powell e WT Mills IV, pelo feedback crítico sobre a descrição da instalação e implementação do gasoduto. Este trabalho foi apoiado por um prêmio da Fundação Braude, o Maryland Stem Cell Research Fund Launch Program, o prêmio Blaustein Endowment for Pain Research and Education e o NINDS RO1NS103974 e NIMH RO1MH129292 para M.K.M.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
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