We presenteren een op maat gemaakt experimenteel platform en weefselkweekprotocol dat fibrokraakbeenachtige verandering nabootst die wordt aangedreven door impingement van de achillespeesinsertie in explantaten van de achterpoten van muizen met aanhoudende cellevensvatbaarheid, en biedt een model dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanobiologie van peesimpingement.
Peesbotsing op bot genereert een multiaxiale mechanische belastingomgeving met duidelijk verhoogde transversale compressieve rek, die een gelokaliseerd fibrokraakbeenfenotype opwekt dat wordt gekenmerkt door accumulatie van glycosaminoglycaan (GAG)-rijke matrix en remodellering van het collageennetwerk. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, zijn overmatige GAG-afzetting en desorganisatie van het collageennetwerk kenmerkende kenmerken van tendinopathie. Dienovereenkomstig wordt impingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor bij het ontstaan en de progressie van tendinopathie. Toch blijft de mechanobiologie die ten grondslag ligt aan peesimpingement onderbelicht. Eerdere pogingen om de cellulaire respons op peesimpingement op te helderen, hebben uniaxiale compressie toegepast op cellen en peesexplantaten in vitro weggesneden. Geïsoleerde cellen missen echter een driedimensionale extracellulaire omgeving die cruciaal is voor de mechanorespons, en zowel in vitro als excitatiestudies kunnen de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo niet recapituleren, wat afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied. Bovendien missen in vivo modellen van peesimpingement controle over de mechanische belastingsomgeving. Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een nieuw explantatiemodel van de achterpoten van muizen dat geschikt is voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespeesimpingement. Dit model houdt de achillespees in situ om de lokale anatomie te behouden en reproduceert de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door botsing van de achillespeesinsertie op de calcaneus tijdens passief toegepaste dorsaalflexie van de enkel met behoud van cellen in hun oorspronkelijke omgeving. We beschrijven een weefselkweekprotocol dat integraal deel uitmaakt van dit model en presenteren gegevens die een duurzame levensvatbaarheid van explantatie gedurende 7 dagen aantonen. De representatieve resultaten tonen een verbeterde histologische GAG-kleuring en verminderde uitlijning van de collageenvezel secundair aan impingement, wat wijst op verhoogde vorming van fibrokraakbeen. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om verschillende mechanische belastingsregimes te onderzoeken en maakt het mogelijk om moleculaire routes te manipuleren die van belang zijn om mechanismen te identificeren die fenotypische veranderingen in de achillespees mediëren als reactie op impingement.
Een groot aantal pezen, waaronder de achillespees en rotator cuff-pezen, ervaren benige impingement als gevolg van normale anatomische positionering1,2,3,4. Peesimpingement genereert drukspanning die dwars op de longitudinale vezelas is gericht5,6,7. Gebieden van peesimpingement vertonen een uniek fenotype van fibrokraakbeen waarin gekrompen, ronde cellen (fibrochondrocyten) zijn ingebed in een ongeorganiseerd collageennetwerk met een duidelijk verhoogd glycosaminoglycaan (GAG)-gehalte2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Eerdere studies suggereren dat de ongelijksoortige mechanische omgeving die wordt geproduceerd door peesimpingement deze GAG-rijke matrix in stand houdt door de afzetting van grote aggregerende proteoglycanen, met name aggrecan, te stimuleren, hoewel de onderliggende mechanismen onduidelijk zijn1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, is een afwijkend proteoglycaanmetabolisme geassocieerd met overmatige vorming van fibrokraakbeen een kenmerkend kenmerk van tendinopathie, een veel voorkomende en slopende ziekte die onevenredig vaak voorkomt bij chronisch aangetaste pezen1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dienovereenkomstig wordt peesimpingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor die verschillende van de meest voorkomende tendinopathieën aandrijft, waaronder rotator cuff-ziekte en insertionele achillespeesontsteking (IAT)50,51,52. Momenteel is de behandeling van tendinopathie inefficiënt. Ongeveer 47% van de patiënten met IAT heeft bijvoorbeeld een chirurgische ingreep nodig na mislukte conservatieve behandeling, met variabele postoperatieve uitkomsten53,54,55,56. Ondanks de schijnbare relatie tussen impingement en tendinopathie, zijn de mechanobiologische mechanismen waarmee cellen in een aangetaste pees hun mechanische omgeving waarnemen en erop reageren, slecht beschreven, wat het begrip van de pathogenese van tendinopathie verduistert en resulteert in een ontoereikende behandeling.
Explantatiemodellen zijn nuttige hulpmiddelen bij de studie van peesmechanobiologie57,58. Als een eerste stap in de richting van het begrijpen van de mechanobiologie van peesimpingement, hebben verschillende eerdere studies de cellulaire respons onderzocht na de toepassing van eenvoudige uniaxiale compressie op cellen of uitgesneden peesexplantaten 27,29,30,31,32,33,34,39. Cellen in vitro missen echter extracellulaire en pericellulaire matrices die de overdracht van spanningen vergemakkelijken, belangrijke groeifactoren en cytokines die vrijkomen door mechanische vervorming sekwestreren en substraat bieden voor focale adhesiecomplexen die een rol spelen bij mechanotransductie57,59. Bovendien kunnen zowel in vitro als excitant-onderzoeken niet worden gerecituleerd in de multiaxiale mechanische belastingsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo, die afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied 5,6. In de context van de beknelde achillespeesinsertie omvat dit omliggende weefsels zoals de retrocalcaneale slijmbeurs en Kager’s vetkussen 60,61,62,63. Omgekeerd bieden in vivo modellen van peesimpingement 25,28,36,37,38,64,65,66 minimale controle over de omvang en frequentie van de belasting die rechtstreeks op de pees wordt uitgeoefend, wat een algemeen erkende beperking is van in vivo modellen voor het bestuderen van peesmechanobiologie 57,58,67,68,69,70. Gezien de uitdagingen bij het meten van peesspanning in vivo, is de interne rekomgeving die in deze modellen wordt gegenereerd vaak slecht gekarakteriseerd.
In dit manuscript presenteren we een op maat gemaakt experimenteel platform dat de invoeging van de achillespees op de calcaneus in de explantaten van de hele muizen van de achterpoten nabootst dat, in combinatie met dit weefselkweekprotocol, de levensvatbaarheid gedurende 7 dagen in explantatiekweek behoudt en studie van de biologische gevolgen van peesimpingement mogelijk maakt. Het platform is gebouwd op een 3D-geprinte polymelkzuur (PLA) basis die de basis vormt voor de bevestiging van de grepen en 3D-geprinte PLA-volumereductie-inzetstukken. De grepen worden gebruikt om het bovenbeen en de knie proximaal van de achillespees-myotendineuze overgang vast te klemmen met het caudale aspect van de achterpoot naar boven gericht, waardoor de achillespees van bovenaf kan worden afgebeeld met behulp van een ultrasone sonde of omgekeerde microscoop (Figuur 1A). Het volumereductie-inzetstuk glijdt langs een spoor op de basis en vermindert het benodigde volume weefselkweekmedia. Een gevlochten lijn die om de achterpoot is gewikkeld, wordt uit het platform geleid met behulp van het basisontwerp en een 3D-geprinte PLA-clip. Door aan het touwtje te trekken, wordt de achterpoot dorsaalgebogen en wordt de aanhechting van de achillespees tegen de calcaneus gedrukt, wat resulteert in een verhoogde dwarsdrukspanning 5,6 (Figuur 1A). Het platform bevindt zich in een acrylbad dat de explantaties van de achterpoot ondergedompeld houdt in weefselkweekmedia. Door het strakke koord met plakband aan de buitenkant van het bad te bevestigen, wordt de dorsaalflexie van de enkel in stand gehouden om statische impingement van de achillespeesinsertie te produceren. CAD-bestanden voor 3D-geprinte componenten worden geleverd in meerdere formaten (aanvullend bestand 1), waardoor ze kunnen worden geïmporteerd in een reeks commerciële en gratis, open-source CAD-software voor aanpassing aan experimentele behoeften. Als er geen toegang tot 3D-printers beschikbaar is voor fabricage, kunnen CAD-bestanden worden verstrekt aan online 3D-printservices die de onderdelen tegen lage kosten printen en verzenden.
Belangrijk is dat het triceps surae-Achilles musculotendineuze complex zowel de knie- als de enkelgewrichten overspant 71,72,73. Bijgevolg wordt de trekspanning in de achillespees beïnvloed door knieflexie. Knie-extensie plaatst de achillespees onder spanning, terwijl knieflexie de spanning vermindert. Door eerst de knie te strekken en vervolgens de enkel passief te dorsaalbuigen, kunnen drukspanningen bij de geïmpacteerde insertie worden gesuperponeerd op trekspanningen. Omgekeerd, door de enkel passief dorsaalbuigend te maken met de knie gebogen, wordt de trekspanning verminderd en blijft de drukspanning bestaan. Het huidige protocol onderzoekt drie van dergelijke voorwaarden. 1) Voor statische impingement wordt de voet dorsaalgebogen tot < 110° ten opzichte van het scheenbeen om de insertie te beïnvloeden, met de knie gebogen om de spanning te verminderen. 2) Voor de basislijnspanningsgroep wordt de enkel gestrekt boven 145° dorsaalflexie met de knie gestrekt, waardoor bij het inbrengen overwegend trekspanning ontstaat. 3) Voor de onbelaste groep worden explantaten gekweekt in een petrischaal met de knie en enkel in neutrale posities in afwezigheid van extern uitgeoefende belasting. De hierboven genoemde hoeken worden fotografisch gemeten ten opzichte van een coördinatensysteem waarbij de voet en het scheenbeen evenwijdig zijn onder een hoek van 180° en loodrecht op een hoek van 90°.
De belangrijkste stappen van het protocol zijn onder meer: 1) dissectie van explantaten van de achterpoten en zorgvuldige verwijdering van de huid en plantarispees; 2) explantatiecultuur na een 48 uur durende voorbehandeling met dexamethason; 3) weefseldoorsnede en histologische kleuring; en 4) kleurenbeeldanalyse om de vorming van fibrokraakbeen te beoordelen. Na dissectie wordt elke explantatie van de achterpoot gedurende 48 uur voorbehandeld in kweekmedia aangevuld met dexamethason74. Contralaterale ledematen van elke muis worden toegewezen aan afzonderlijke experimentele groepen voor paarsgewijze vergelijking, wat helpt bij het beheersen van biologische variabiliteit. Na de voorbehandeling worden de explantaten op platforms geplaatst zoals hierboven beschreven en nog 7 dagen gekweekt (Figuur 1B). Aanvullende vergelijkingen worden gemaakt met een voorbehandelde (dag 0) groep waarin explantaten direct na de 48 uur voorbehandeling worden verwijderd.
Na explantatiecultuur worden de achterpoten bijgesneden, formaline gefixeerd, ontkalkt en ingebed in paraffine. Seriële doorsnede in sagittale oriëntatie biedt visualisatie van de achillespees vanaf de myotendineuze overgang tot de calcaneale insertie, terwijl de sectiediepte door de hele pees kan worden gevolgd. Terminale deoxynucleotidyltransferase (TdT)-gemedieerde dUTP X-nick-labeling (TUNEL) wordt gebruikt om DNA-schade secundair aan apoptose te visualiseren en de levensvatbaarheid te beoordelen. Toluïdineblauwe histologie en aangepaste kleurenbeeldanalyse worden uitgevoerd om veranderingen in GAG-kleuring te kwantificeren. Toluïdineblauw gekleurde weefselsecties worden vervolgens gebruikt voor SHG-beeldvorming om veranderingen in de organisatie van collagevezels te karakteriseren (Figuur 1B).
De verstrekte representatieve resultaten suggereren een veranderde histologische kleuring van de GAG-rijke matrix en desorganisatie van het extracellulaire collageennetwerk gegenereerd door 7 dagen statische impingement binnen het model. Dit model kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan impingement-gedreven fibrokraakbeenachtige verandering.
Het experimentele explantatieplatform van de achterpoten van muizen in combinatie met het weefselkweekprotocol dat in deze studie wordt beschreven, biedt een geschikt model voor het bestuderen van de mechanobiologie van impingement-gedreven fibrokraakbeenvorming bij de insertie van de achillespees. Het nut van dit explantatiemodel wordt aangetoond door de representatieve resultaten, die wijzen op behoud van de levensvatbaarheid van de cellen gelijktijdig met een significante en ruimtelijk heterogene verandering in Toluï…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn dankbaar voor de steun en hulp van Jeff Fox en Vidya Venkatramani van de Histology, Biochemistry and Molecular Imaging (HBMI) Core van het University of Rochester Center for Musculoskeletal Research, gedeeltelijk gefinancierd door P30AR06965. Daarnaast willen de auteurs het Centrum voor Lichtmicroscopie en Nanoscopie (CALMN) van het University of Rochester Medical Center bedanken voor hulp bij multifotonenmicroscopie. Deze studie werd gefinancierd door R01 AR070765 en R01 AR070765-04S1, evenals 1R35GM147054 en 1R01AR082349.
Absorbent underpads | VWR | 82020-845 | For benchtop dissection |
Acrylic bath | Source One | X001G46CB1 | Contains the explant platform submerged in culture media |
Autoclave bin | Thermo Scientific | 13-361-20 | Used as secondary containment, holds two platforms |
Base | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Braided line | KastKing | 30lb test | Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion |
Clip | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Cover glass | Fisherbrand | 12-541-034 | Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm |
Cytoseal XYL | VWR | 8312-4 | Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections |
Dexamethasone | MP Biomedical LLC | 194561 | CAS#50-02-2 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Invitrogen by ThermoFisher | D12345 | CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions |
Double-sided tape | Scotch Brand | 34-8724-5195-9 | To attach sandpaper to Grip platens |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) | Gibco by ThermoFisher | 11965092 | high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine |
EDTA tetrasodium salt dihydrate | Thermo Scientific Chemicals | J15700.A1 | CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation |
Ethanol, 200 proof | Thermo Scientific | T038181000 | CAS#64-17-5, 1 L supply |
Foam biopsy pads | Leica | 3801000 | Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification |
Forceps, #SS Standard Inox | Dumont | 11203-23 | Straight, smooth, fine tips |
Forceps, Micro-Adson 4.75" | Fisherbrand | 13-820-073 | Straight, fine tips with serrated teeth |
Garnet Sandpaper, 50-D Grit | Norton | M600060 01518 | Or other coarse grit sandpaper |
Glacial acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution |
Grips | ADMET | GV-100NT-A4 | Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included |
Histobond Adhesive Microscope Slides | VWR | 16005-108 | Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols |
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
Labeling tape | Fisherbrand | 15-959 | Or any other labeling tape of preference |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | CAS#50-81-7, for culture media formulation |
Neutral buffered formalin, 10% | Leica | 3800600 | For sample fixation, 5 gallon supply |
Nunc petri dishes | Sigma-Aldrich | P7741-1CS | 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol |
Penicillin-streptomycin (100X) | Gibco by ThermoFisher | 15140122 | Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration |
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament | Hatchbox | – | Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice. |
Processing cassettes | Leica | 3802631 | For fixation, decalcification and paraffin embedding |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen by ThermoFisher | P36931 | Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL |
Proteinase K | Fisher BioReagents | BP1700-50 | CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol |
Scissors, Fine | FST | 14094-11 | Straight, sharp |
Slide Staining Set, 12-place | Mercedes Scientific | MER 1011 | Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology |
Sodium acetate, anhydrous | Thermo Scientific Chemicals | A1318430 | CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades | VWR | 25608-964 | For paraffin sectioning |
Toluidine Blue O | Thermo Scientific Chemicals | 348601000 | CAS#92-31-9 |
Volume Reduction Insert | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Xylenes | Leica | 3803665 | 4 gallon supply for histological staining |