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Bio-ingénierie

Achilles कण्डरा Impingement के मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए Murine हिंद लिंब एक्सप्लांट मॉडल

Published: December 08, 2023
doi:
10.3791/65801
, , ,
1Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research,University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology,University of Rochester Medical Center

Summary

हम एक कस्टम प्रयोगात्मक मंच और टिशू कल्चर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो निरंतर सेल व्यवहार्यता के साथ murine हिंद अंग explants में Achilles कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव से प्रेरित फाइब्रोकार्टिलाजिनस परिवर्तन को फिर से बनाता है, जो कण्डरा टकराव के mechanobiology की खोज के लिए उपयुक्त मॉडल प्रदान करता है।

Abstract

हड्डी पर कण्डरा प्रभाव स्पष्ट रूप से ऊंचा अनुप्रस्थ संपीड़ित तनाव के साथ एक बहुअक्षीय यांत्रिक तनाव वातावरण उत्पन्न करता है, जो ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) -समृद्ध मैट्रिक्स के संचय और कोलेजन नेटवर्क के रीमॉडेलिंग द्वारा विशेषता वाले स्थानीयकृत फाइब्रोकार्टिलेज फेनोटाइप को प्राप्त करता है। जबकि फाइब्रोकार्टिलेज स्वस्थ टेंडन के प्रभावित क्षेत्रों में एक सामान्य विशेषता है, अतिरिक्त जीएजी जमाव और कोलेजन नेटवर्क की अव्यवस्था टेंडिनोपैथी की पहचान विशेषताएं हैं। तदनुसार, टेंडिनोपैथी की दीक्षा और प्रगति में एक महत्वपूर्ण बाहरी कारक के रूप में चिकित्सकीय रूप से मान्यता प्राप्त है। फिर भी, कण्डरा टकराव अंतर्निहित मैकेनोबायोलॉजी का अध्ययन नहीं किया गया है। कण्डरा टकराव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को स्पष्ट करने के पूर्व प्रयासों ने कोशिकाओं के लिए एकअक्षीय संपीड़न लागू किया है और इन विट्रो में कण्डरा एक्सप्लांट्स को उत्तेजित किया है। हालांकि, पृथक कोशिकाओं में मेकेनोरेस्पॉन्स के लिए महत्वपूर्ण त्रि-आयामी बाह्य वातावरण की कमी होती है, और इन विट्रो और एक्सक्साइड एक्सप्लांट अध्ययन दोनों विवो में कण्डरा टकराव द्वारा उत्पन्न बहुअक्षीय तनाव वातावरण को पुन: प्राप्त करने में विफल रहते हैं, जो कि प्रभावित क्षेत्र की शारीरिक विशेषताओं पर निर्भर करता है। इसके अलावा, कण्डरा टकराव के विवो मॉडल में यांत्रिक तनाव पर्यावरण पर नियंत्रण की कमी होती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक उपन्यास murine हिंद अंग explant मॉडल प्रस्तुत Achilles कण्डरा impingement के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है. यह मॉडल स्थानीय शरीर रचना को संरक्षित करने के लिए एच्लीस कण्डरा को सीटू में बनाए रखता है और अपने मूल वातावरण के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखते हुए निष्क्रिय रूप से लागू टखने के डॉर्सिफ्लेक्सियन के दौरान कैल्केनस पर एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव से उत्पन्न बहुअक्षीय तनाव वातावरण को पुन: पेश करता है। हम इस मॉडल के अभिन्न अंग एक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और 7 दिनों में निरंतर एक्सप्लांट व्यवहार्यता स्थापित करने वाले डेटा प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम बढ़ाया हिस्टोलॉजिकल जीएजी धुंधला प्रदर्शित करते हैं और कोलेजन फाइबर संरेखण माध्यमिक को प्रभावित करने के लिए कम हो जाते हैं, ऊंचा फाइब्रोकार्टिलेज गठन का सुझाव देते हैं। इस मॉडल को आसानी से विभिन्न यांत्रिक लोडिंग रेजिमेंस की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और प्रभाव के जवाब में एच्लीस कण्डरा में फेनोटाइपिक परिवर्तन की मध्यस्थता करने वाले तंत्र की पहचान करने के लिए ब्याज के आणविक मार्गों में हेरफेर की अनुमति देता है।

Introduction

एच्लीस कण्डरा और रोटेटर कफ टेंडन सहित टेंडन की एक भीड़, सामान्य शारीरिक स्थिति के कारण बोनी टकराव का अनुभव करती है1,2,3,4. कण्डरा टकराव अनुदैर्ध्य फाइबर अक्ष के लिए अनुप्रस्थ रूप से निर्देशित संपीड़ित तनाव उत्पन्न करता है5,6,7. कण्डरा टकराव के क्षेत्र एक अद्वितीय फाइब्रोकार्टिलेज फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं जिसमें सिकुड़े, गोल कोशिकाएं (फाइब्रोकॉन्ड्रोसाइट्स) एक असंगठित कोलेजन नेटवर्क के भीतर एम्बेडेड होती हैं जिसमें स्पष्ट रूप से ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी) सामग्री होती है2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. पहले के अध्ययनों से पता चलता है कि कण्डरा टकराव द्वारा उत्पादित असमान यांत्रिक वातावरण बड़े एकत्रीकरण प्रोटीओग्लाइकेन्स के जमाव को चलाकर इस जीएजी-समृद्ध मैट्रिक्स को बनाए रखता है, विशेष रूप से एग्रीकेन, हालांकि अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं हैं1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. जबकि फाइब्रोकार्टिलेज स्वस्थ टेंडन के प्रभावित क्षेत्रों में एक सामान्य विशेषता है, अत्यधिक फाइब्रोकार्टिलेज गठन से जुड़ा असामान्य प्रोटियोग्लाइकन चयापचय टेंडिनोपैथी की एक बानगी विशेषता है, जो एक आम और दुर्बल करने वाली बीमारी है जो कालानुक्रमिक रूप से प्रभावित टेंडन में उभरती है1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. तदनुसार, कण्डरा टकराव को नैदानिक रूप से एक महत्वपूर्ण बाहरी कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है, जो रोटेटर कफ रोग और सम्मिलन अकिलीज़ टेंडिनोपैथी (आईएटी) सहित कई सबसे आम टेंडिनोपैथियों को चलाता है50,51,52. वर्तमान में, टेंडिनोपैथी का उपचार अक्षम है। उदाहरण के लिए, आईएटी के लगभग 47% रोगियों को परिवर्तनीय पश्चात परिणामों के साथ असफल रूढ़िवादी प्रबंधन के बाद सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है53,54,55,56. प्रभाव और टेंडिनोपैथी के बीच स्पष्ट संबंध के बावजूद, मेकेनोबायोलॉजिकल तंत्र जिसके द्वारा कोशिकाओं को कण्डरा अर्थ में लगाया जाता है और उनके यांत्रिक वातावरण का जवाब दिया जाता है, खराब रूप से वर्णित किया जाता है, जो टेंडिनोपैथी रोगजनन की समझ को अस्पष्ट करता है और परिणामस्वरूप अपर्याप्त उपचार होता है।

एक्सप्लांट मॉडल कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी57,58 के अध्ययन में उपयोगी उपकरण हैं। कण्डरा टकराव के मेकेनोबायोलॉजी को समझने की दिशा में पहले कदम के रूप में, कई पूर्व अध्ययनों ने कोशिकाओं या एक्साइज्ड कण्डराएक्सप्लांट्स 27,29,30,31,32,33,34,39 के लिए सरल एकअक्षीय संपीड़न के आवेदन के बाद सेलुलर प्रतिक्रिया का पता लगाया है। हालांकि, इन विट्रो में कोशिकाओं में बाह्य और पेरिकोल्युलर मैट्रिसेस की कमी होती है जो तनाव हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं, यांत्रिक विरूपण द्वारा जारी महत्वपूर्ण विकास कारकों और साइटोकिन्स को अनुक्रमित करते हैं, और फोकल आसंजन परिसरों के लिए सब्सट्रेट प्रदान करते हैं जो मैकेनोट्रांसडक्शन57,59में भूमिका निभाते हैं। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो और एक्साइज़्ड एक्सप्लांट अध्ययन दोनों विवो में कण्डरा टकराने से उत्पन्न बहुअक्षीय यांत्रिक तनाव वातावरण को पुन: व्यवस्थित करने में विफल रहते हैं, जो कि प्रभावित क्षेत्र 5,6 की शारीरिक विशेषताओं पर निर्भर करता है। इम्पिंग्ड अकिलीज़ टेंडन सम्मिलन के संदर्भ में, इसमें आसपास के ऊतक जैसे रेट्रोकैल्केनियल बर्सा और केगर का वसा पैड60,61,62,63 शामिल हैं। इसके विपरीत, कण्डरा टकराव 25,28,36,37,38,64,65,66 के विवो मॉडल में सीधे कण्डरा पर लागू भार की भयावहता और आवृत्ति पर न्यूनतम नियंत्रण की अनुमति देता है, जो कण्डरा मेकेनोबायोलॉजी 57,58 का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त सीमा है,67,68,69,70. विवो में कण्डरा तनाव को मापने में चुनौतियों को देखते हुए, इन मॉडलों के भीतर उत्पन्न आंतरिक तनाव वातावरण अक्सर खराब विशेषता है।

इस पांडुलिपि में, हम एक कस्टम प्रयोगात्मक मंच प्रस्तुत करते हैं जो पूरे म्यूरिन हिंद अंग एक्सप्लांट्स के भीतर कैल्केनस पर एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के प्रभाव को फिर से बनाता है, जब इस ऊतक संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जाता है, तो एक्सप्लांट कल्चर में 7 दिनों से अधिक व्यवहार्यता बनाए रखता है और अध्ययन की अनुमति देता है कण्डरा टकराव के जैविक अनुक्रम। प्लेटफ़ॉर्म एक 3D प्रिंटेड पॉलीलैक्टिक एसिड (PLA) बेस पर बनाया गया है जो ग्रिप्स के अटैचमेंट और 3D प्रिंटेड PLA वॉल्यूम रिडक्शन इंसर्ट के लिए नींव प्रदान करता है। पकड़ का उपयोग ऊपरी पैर और घुटने के समीपस्थ को अकिलीज़ मायोटेंडिनस जंक्शन पर ऊपर की ओर हिंद अंग के दुम के पहलू के साथ करने के लिए किया जाता है, जिससे अल्ट्रासाउंड जांच या उल्टे माइक्रोस्कोप(चित्रा 1ए)का उपयोग करके ऊपर से एच्लीस कण्डरा को इमेज किया जा सकता है। वॉल्यूम में कमी आधार पर एक ट्रैक के साथ स्लाइड सम्मिलित करती है और टिशू कल्चर मीडिया की आवश्यक मात्रा को कम करती है। हिंद पंजा के चारों ओर लिपटी एक लट रेखा को आधार डिजाइन और एक 3 डी प्रिंटेड पीएलए क्लिप का उपयोग करके मंच से बाहर निकाला जाता है। स्ट्रिंग पर खींचकर, हिंद पंजा dorsiflexed है, और Achilles कण्डरा सम्मिलन calcaneus के खिलाफ impinged है, ऊंचा अनुप्रस्थ संपीड़न तनाव 5,6 (चित्रा 1 ए) में जिसके परिणामस्वरूप. मंच एक ऐक्रेलिक स्नान के भीतर निहित है जो टिशू कल्चर मीडिया में डूबे हिंद अंग एक्सप्लांट को बनाए रखता है। चिपकने वाली टेप के साथ स्नान के बाहर तना हुआ स्ट्रिंग सुरक्षित करने से एच्लीस कण्डरा सम्मिलन के स्थिर प्रभाव का उत्पादन करने के लिए टखने के डोरसिफ्लेक्सियन को बनाए रखता है। 3 डी मुद्रित घटकों के लिए सीएडी फाइलें कई प्रारूपों (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की जाती हैं, जो प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधन के लिए वाणिज्यिक और मुक्त, ओपन-सोर्स सीएडी सॉफ्टवेयर की एक श्रृंखला में आयात की अनुमति देती हैं। यदि निर्माण के लिए 3 डी प्रिंटर तक पहुंच उपलब्ध नहीं है, तो सीएडी फाइलें ऑनलाइन 3 डी प्रिंटिंग सेवाओं को प्रदान की जा सकती हैं जो कम लागत पर भागों को प्रिंट और शिप करेंगी।

महत्वपूर्ण रूप से, ट्राइसेप्स सुरा-अकिलीज़ मस्कुलोटेंडिनस कॉम्प्लेक्स घुटने और टखने दोनों जोड़ों को 71,72,73 तक फैलाता है। नतीजतन, अकिलीज़ कण्डरा में तन्यता तनाव घुटने के लचीलेपन से प्रभावित होता है। घुटने का विस्तार अकिलीज़ कण्डरा को तनाव में रखता है, जबकि घुटने का लचीलापन तनाव को कम करता है। पहले घुटने का विस्तार करके और फिर टखने को निष्क्रिय रूप से डॉर्सिफ्लेक्स करके, टखने को दबाने वाले सम्मिलन पर संपीड़ित उपभेदों को तन्यता उपभेदों पर आरोपित किया जा सकता है। इसके विपरीत, घुटने के फ्लेक्स के साथ टखने को निष्क्रिय रूप से डॉर्सिफ्लेक्स करके, तन्यता तनाव कम हो जाता है, और संपीड़ित तनाव बना रहता है। वर्तमान प्रोटोकॉल तीन ऐसी स्थितियों की पड़ताल करता है। 1) स्थैतिक टकराव के लिए, पैर को टिबिया के संबंध में 110 ° < करने के लिए पृष्ठीय किया जाता है ताकि सम्मिलन को प्रभावित किया जा सके, तनाव को कम करने के लिए घुटने को फ्लेक्स किया जाता है। 2) आधारभूत तनाव समूह के लिए, टखने को घुटने के साथ डोरसिफ्लेक्सियन के 145 ° से ऊपर बढ़ाया जाता है, जिससे सम्मिलन पर मुख्य रूप से तन्यता तनाव पैदा होता है। 3) अनलोड किए गए समूह के लिए, बाहरी रूप से लागू भार की अनुपस्थिति में तटस्थ स्थिति में घुटने और टखने के साथ पेट्री डिश में एक्सप्लांट्स को सुसंस्कृत किया जाता है। ऊपर उल्लिखित कोणों को एक समन्वय प्रणाली के सापेक्ष फोटोग्राफिक रूप से मापा जाता है जहां पैर और टिबिया 180 ° के कोण पर समानांतर होते हैं और 90 ° के कोण पर लंबवत होते हैं।

प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में शामिल हैं 1) हिंद अंग explants के विच्छेदन और त्वचा और plantaris कण्डरा के सावधान हटाने; 2) 48 घंटे डेक्सामेथासोन प्रीट्रीटमेंट के बाद एक्सप्लांट कल्चर; 3) ऊतक सेक्शनिंग और हिस्टोलॉजिकल धुंधला; और 4) फाइब्रोकार्टिलेज गठन का आकलन करने के लिए रंग छवि विश्लेषण। विच्छेदन के बाद, प्रत्येक हिंद अंग एक्सप्लांट को डेक्सामेथासोन74 के साथ पूरक संस्कृति मीडिया में 48 घंटे के लिए पूर्ववत किया जाता है। प्रत्येक माउस से contralateral अंगों जोड़ीदार तुलना, जो जैविक परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने में मदद करता है के लिए अलग प्रयोगात्मक समूहों को सौंपा जाता है. दिखावा के बाद, एक्सप्लांट्स को ऊपर वर्णित प्लेटफार्मों में तैनात किया जाता है और 7 और दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है (चित्र 1बी)। अतिरिक्त तुलना एक पूर्व उपचारित (दिन 0) समूह के लिए की जाती है जिसमें 48 घंटे के प्रीट्रीटमेंट के तुरंत बाद एक्सप्लांट हटा दिए जाते हैं।

एक्सप्लांट कल्चर के बाद, हिंद अंगों को छंटनी की जाती है, फॉर्मेलिन को ठीक किया जाता है, डिकैल्सीफाइड और पैराफिन में एम्बेडेड किया जाता है। धनु अभिविन्यास में सीरियल सेक्शनिंग पूरे कण्डरा के माध्यम से अनुभाग गहराई को ट्रैक करने की अनुमति देते हुए मायोटेंडिनस जंक्शन से कैल्केनियल सम्मिलन तक एच्लीस कण्डरा का दृश्य प्रदान करता है। टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइडिल ट्रांसफरेज़ (टीडीटी) -मध्यस्थता डीएटीपी एक्स-निक लेबलिंग (ट्यूनल) का उपयोग एपोप्टोसिस के लिए डीएनए क्षति माध्यमिक की कल्पना करने और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है। टोलुइडाइन ब्लू हिस्टोलॉजी और कस्टम रंग छवि विश्लेषण जीएजी धुंधला में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। टोलुइडाइन नीले सना हुआ ऊतक वर्गों तो कोलाज फाइबर संगठन (चित्रा 1 बी) में परिवर्तन की विशेषता के लिए एसएचजी इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है.

प्रदान किए गए प्रतिनिधि परिणाम जीएजी-समृद्ध मैट्रिक्स के परिवर्तित हिस्टोलॉजिकल धुंधला होने और मॉडल के भीतर 7 दिनों के स्थिर प्रभाव से उत्पन्न बाह्य कोलेजन नेटवर्क के अव्यवस्था का सुझाव देते हैं। इस मॉडल का उपयोग आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जो प्रभाव-संचालित फाइब्रोकार्टिलाजिनस परिवर्तन के अंतर्निहित है।

Protocol

सभी जानवरों के काम को पशु संसाधन पर रोचेस्टर समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। 1. टिशू कल्चर मीडिया की तैयारी संस्कृति Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (1x DMEM) में 1% वी / वी पेनि?…

Representative Results

ट्यूनल सना हुआ ऊतक वर्गों की प्रतिनिधि छवियां प्रयोगात्मक समूहों(चित्रा 2ए)में एक्सप्लांट कल्चर के 7 दिनों के बाद अकिलीज़ कण्डरा के शरीर के भीतर न्यूनतम एपोप्टोटिक नाभिक प्रदर्शित करती है?…

Discussion

इस अध्ययन में वर्णित टिशू कल्चर प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा गया प्रायोगिक murine हिंद अंग एक्सप्लांट प्लेटफॉर्म Achilles कण्डरा सम्मिलन पर impingement संचालित fibrocartilage गठन के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रदा…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक रोचेस्टर सेंटर फॉर मस्कुलोस्केलेटल रिसर्च के हिस्टोलॉजी, बायोकैमिस्ट्री और आणविक इमेजिंग (एचबीएमआई) कोर के जेफ फॉक्स और विद्या वेंकटरमानी द्वारा प्रदान किए गए समर्थन और सहायता के लिए आभारी हैं, जो P30AR06965 द्वारा भाग में वित्त पोषित है। इसके अतिरिक्त, लेखक मल्टीफोटन माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए रोचेस्टर मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में सेंटर फॉर लाइट माइक्रोस्कोपी और नैनोस्कोपी (CALMN) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस अध्ययन को R01 AR070765 और R01 AR070765-04S1, साथ ही 1R35GM147054 और 1R01AR082349 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox – Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining
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References

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Keywords: Murine Hind LimbExplant ModelMechanobiologyAchilles Tendon ImpingementMultiaxial Mechanical StrainFibrocartilageTendinopathyIn Vitro ModelIn Vivo ModelExtracellular MatrixGlycosaminoglycan (GAG)Collagen Network
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).
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