Modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille

Summary

Presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata e un protocollo di coltura tissutale che ricrea il cambiamento fibrocartilagineo guidato dall’impingement dell’inserzione del tendine d’Achille in espianti murini dell’arto posteriore con vitalità cellulare sostenuta, fornendo un modello adatto per esplorare la meccanobiologia dell’impingement tendineo.

Abstract

L’impingement del tendine sull’osso genera un ambiente di deformazione meccanica multiassiale con deformazione compressiva trasversale marcatamente elevata, che suscita un fenotipo localizzato della fibrocartilagine caratterizzato dall’accumulo di matrice ricca di glicosaminoglicani (GAG) e dal rimodellamento della rete di collagene. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, l’eccesso di deposizione di GAG e la disorganizzazione della rete di collagene sono caratteristiche distintive della tendinopatia. Di conseguenza, l’impingement è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco nell’inizio e nella progressione della tendinopatia. Ciononostante, la meccanobiologia alla base dell’impingement tendineo rimane poco studiata. Gli sforzi precedenti per chiarire la risposta cellulare all’impingement tendineo hanno applicato la compressione uniassiale alle cellule e asportato espianti tendinei in vitro. Tuttavia, le cellule isolate mancano di un ambiente extracellulare tridimensionale cruciale per la meccanorisposta, e sia gli studi in vitro che quelli sull’espianto asportato non riescono a ricapitolare l’ambiente di deformazione multiassiale generato dall’impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata. Inoltre, i modelli in vivo di impingement tendineo mancano di controllo sull’ambiente di deformazione meccanica. Per superare queste limitazioni, presentiamo un nuovo modello murino di espianto dell’arto posteriore adatto allo studio della meccanobiologia dell’impingement del tendine d’Achille. Questo modello mantiene il tendine d’Achille in situ per preservare l’anatomia locale e riproduce l’ambiente di deformazione multiassiale generato dall’impatto dell’inserzione del tendine d’Achille sul calcagno durante la flessione dorsale della caviglia applicata passivamente, mantenendo le cellule all’interno del loro ambiente nativo. Descriviamo un protocollo di coltura tissutale parte integrante di questo modello e presentiamo i dati che stabiliscono la vitalità dell’espianto sostenuta per 7 giorni. I risultati rappresentativi dimostrano una migliore colorazione istologica del GAG e una diminuzione dell’allineamento delle fibre di collagene secondarie al impingement, suggerendo un’elevata formazione di fibrocartilagine. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare diversi regimi di carico meccanico e consente la manipolazione di percorsi molecolari di interesse per identificare i meccanismi che mediano il cambiamento fenotipico nel tendine d’Achille in risposta all’impingement.

Introduction

Una moltitudine di tendini, tra cui il tendine d’Achille e i tendini della cuffia dei rotatori, subiscono un conflitto osseo a causa del normale posizionamento anatomico^1,2,3,4. L’impingement tendineo genera una deformazione di compressione diretta trasversalmente all’asse longitudinale della fibra^5,6,7. Le regioni di conflitto tendineo dimostrano un fenotipo unico della fibrocartilagine in cui le cellule rotonde e rimpicciolite (fibrocondrociti) sono incorporate all’interno di una rete di collagene disorganizzata con un contenuto di glicosaminoglicani (GAG) marcatamente aumentato^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Studi precedenti suggeriscono che il disparato ambiente meccanico prodotto dall’impingement tendineo sostiene questa matrice ricca di gag guidando la deposizione di grandi proteoglicani aggreganti, in particolare l’aggrecano, anche se i meccanismi sottostanti non sono chiari^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, il metabolismo aberrante dei proteoglicani associato all’eccessiva formazione di fibrocartilagine è una caratteristica distintiva della tendinopatia, una malattia comune e debilitante che emerge in modo sproporzionato nei tendini cronicamente impattati^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Di conseguenza, l’impingement tendineo è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco alla base di molte delle tendinopatie più comuni, tra cui la malattia della cuffia dei rotatori e la tendinopatia inserzionale del tendine d’Achille (IAT)^50,51,52. Attualmente, il trattamento della tendinopatia è inefficiente. Ad esempio, circa il 47% dei pazienti con IAT richiede un intervento chirurgico dopo una gestione conservativa fallita, con esiti postoperatori variabili^53,54,55,56. Nonostante l’apparente relazione tra impingement e tendinopatia, i meccanismi meccanobiologici attraverso i quali le cellule nel tendine impattato percepiscono e rispondono al loro ambiente meccanico sono scarsamente descritti, il che oscura la comprensione della patogenesi della tendinopatia e si traduce in un trattamento inadeguato.

I modelli di espianto sono strumenti utili nello studio della meccanobiologia tendinea^57,58. Come primo passo verso la comprensione della meccanobiologia dell’impingement tendineo, diversi studi precedenti hanno esplorato la risposta cellulare in seguito all’applicazione di una semplice compressione uniassiale alle cellule o agli espianti di tendini^asportati 27,29,30,31,32,33,34,39. Tuttavia, le cellule in vitro mancano di matrici extracellulari e pericellulari che facilitano il trasferimento di ceppi, sequestrano importanti fattori di crescita e citochine rilasciate dalla deformazione meccanica e forniscono substrato per complessi di adesione focale che svolgono un ruolo nella meccanotrasduzione^57,59. Inoltre, sia gli studi in vitro che quelli con espianto asportato non riescono a ricapitolare l’ambiente di deformazione meccanica multiassiale generato dall’impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata ^5,6. Nel contesto dell’inserzione del tendine d’Achille impattata, ciò include i tessuti circostanti come la borsa retrocalcaneare e il cuscinetto adiposo 60,61,62,63 di Kager. Al contrario, i modelli in vivo di impingement tendineo 25,28,36,37,38,64,65,66 consentono un controllo minimo sull’entità e sulla frequenza del carico applicato direttamente al tendine, che è una limitazione ben nota dei modelli in vivo per lo studio della meccanobiologia tendinea ^57,58,67,68,69,70. Date le sfide nella misurazione della deformazione tendinea in vivo, l’ambiente di deformazione interna generato all’interno di questi modelli è spesso scarsamente caratterizzato.

In questo manoscritto, presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata che ricrea l’impingement dell’inserzione del tendine d’Achille sul calcagno all’interno di espianti dell’arto posteriore murino intero che, se abbinato a questo protocollo di coltura tissutale, mantiene la vitalità per 7 giorni in coltura di espianto e consente lo studio delle sequele biologiche dell’impingement tendineo. La piattaforma è costruita su una base di acido polilattico (PLA) stampata in 3D che fornisce la base per il fissaggio delle impugnature e l’inserto di riduzione del volume in PLA stampato in 3D. Le impugnature vengono utilizzate per bloccare la parte superiore della gamba e il ginocchio prossimale alla giunzione miotendinea di Achille con l’aspetto caudale dell’arto posteriore rivolto verso l’alto, consentendo di visualizzare il tendine d’Achille dall’alto utilizzando una sonda a ultrasuoni o un microscopio invertito (Figura 1A). L’inserto di riduzione del volume scorre lungo un binario sulla base e riduce il volume richiesto dei terreni di coltura tissutale. Una linea intrecciata avvolta attorno alla zampa posteriore viene instradata fuori dalla piattaforma utilizzando il design della base e una clip in PLA stampata in 3D. Tirando la corda, la zampa posteriore viene dorsiflessa e l’inserzione del tendine d’Achille viene urtata contro il calcagno, con conseguente elevata deformazione di compressione trasversale ^5,6 (Figura 1A). La piattaforma è contenuta all’interno di un bagno acrilico che mantiene gli espianti dell’arto posteriore immersi nei terreni di coltura tissutale. Fissando la corda tesa all’esterno della vasca con nastro adesivo si mantiene la flessione dorsale della caviglia per produrre un impatto statico dell’inserzione del tendine d’Achille. I file CAD per i componenti stampati in 3D sono forniti in più formati (File supplementare 1), consentendo l’importazione in una gamma di software CAD commerciali e gratuiti open source per la modifica in base alle esigenze sperimentali. Se l’accesso alle stampanti 3D non è disponibile per la fabbricazione, i file CAD possono essere forniti ai servizi di stampa 3D online che stamperanno e spediranno le parti a basso costo.

È importante sottolineare che il complesso muscolotendineo tricipite surale-achille si estende su entrambe le articolazioni del ginocchio e della caviglia 71,72,73. Di conseguenza, la tensione di trazione nel tendine d’Achille è influenzata dalla flessione del ginocchio. L’estensione del ginocchio mette in tensione il tendine d’Achille, mentre la flessione del ginocchio riduce la tensione. Estendendo prima il ginocchio e poi flettendo passivamente la caviglia, le deformazioni di compressione all’inserzione impattata possono essere sovrapposte alle deformazioni di trazione. Al contrario, flettendo passivamente la caviglia con il ginocchio flesso, la tensione di trazione si riduce e la tensione di compressione rimane. L’attuale protocollo esplora tre di queste condizioni. 1) Per l’impingement statico, il piede viene piegato dorsalmente a < 110° rispetto alla tibia per ostacolare l'inserimento, con il ginocchio flesso per ridurre la tensione. 2) Per il gruppo di tensione basale, la caviglia viene estesa oltre i 145° di flessione dorsale con il ginocchio esteso, generando una tensione di trazione prevalente all'inserzione. 3) Per il gruppo scarico, gli espianti vengono coltivati in una capsula di Petri con il ginocchio e la caviglia in posizione neutra in assenza di carico applicato esternamente. Gli angoli di cui sopra sono misurati fotograficamente rispetto a un sistema di coordinate in cui il piede e la tibia sono paralleli con un angolo di 180° e perpendicolari con un angolo di 90°.

Le fasi chiave del protocollo includono: 1) la dissezione degli espianti degli arti posteriori e l’attenta rimozione della cute e del tendine plantare; 2) coltura di espianto dopo un pretrattamento di 48 ore con desametasone; 3) sezionamento tissutale e colorazione istologica; e 4) analisi dell’immagine a colori per valutare la formazione di fibrocartilagine. Dopo la dissezione, ogni espianto dell’arto posteriore viene pretrattato per 48 ore in terreni di coltura integrati con desametasone⁷⁴. Gli arti controlaterali di ciascun topo vengono assegnati a gruppi sperimentali separati per il confronto a coppie, che aiuta a controllare la variabilità biologica. Dopo il pretrattamento, gli espianti vengono posizionati su piattaforme come descritto sopra e coltivati per altri 7 giorni (Figura 1B). Ulteriori confronti vengono effettuati con un gruppo pretrattato (giorno 0) in cui gli espianti vengono rimossi immediatamente dopo il pretrattamento di 48 ore.

Dopo la coltura dell’espianto, gli arti posteriori vengono tagliati, fissati in formalina, decalcificati e incorporati in paraffina. Il sezionamento seriale in orientamento sagittale fornisce la visualizzazione del tendine d’Achille dalla giunzione miotendinea all’inserzione calcaneare, consentendo al contempo di monitorare la profondità della sezione attraverso l’intero tendine. La marcatura dUTP X-nick mediata dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (TUNEL) viene utilizzata per visualizzare il danno al DNA secondario all’apoptosi e valutare la vitalità. L’istologia del blu di toluidina e l’analisi dell’immagine a colori personalizzata vengono eseguite per quantificare i cambiamenti nella colorazione GAG. Le sezioni di tessuto colorate con blu di toluidina vengono quindi utilizzate per l’imaging SHG per caratterizzare le alterazioni nell’organizzazione delle fibre del collage (Figura 1B).

I risultati rappresentativi forniti suggeriscono un’alterata colorazione istologica della matrice ricca di gag e la disorganizzazione della rete di collagene extracellulare generata da 7 giorni di impingement statico all’interno del modello. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i meccanismi molecolari alla base del cambiamento fibrocartilagineo guidato dall’impingement.

Protocol

Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato per le risorse animali dell’Università di Rochester. 1. Preparazione dei terreni di coltura tissutale Coltivare tutti gli espianti in Modified Eagle Medium di Dulbecco (1x DMEM) con penicillina-streptomicina all’1% v/v e acido L-ascorbico 200 μM in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 . Per il pretrattamento iniziale di 48 ore, coltura di ciascun espianto in 70 mL di terreno di coltura integrato…

Representative Results

Le immagini rappresentative delle sezioni di tessuto colorate con TUNEL dimostrano nuclei apoptotici minimi all’interno del corpo del tendine d’Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutti i gruppi sperimentali (Figura 2A). La quantificazione di queste immagini fornisce la prova che il protocollo di coltura tissutale mantiene in media fino al 78% di vitalità all’interno del tendine d’Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutte le condizioni di carico (<strong class="xfig"…

Discussion

La piattaforma sperimentale di espianto dell’arto posteriore murino abbinata al protocollo di coltura tissutale descritto in questo studio fornisce un modello adatto per studiare la meccanobiologia della formazione di fibrocartilagine guidata dal conflitto all’inserzione del tendine d’Achille. L’utilità di questo modello di espianto è dimostrata dai risultati rappresentativi, che indicano il mantenimento della vitalità cellulare in concomitanza con un cambiamento significativo e spazialmente eterogeneo nella colorazio…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining