Murine Hind Limb Explant modell for å studere mekanobiologi av akillesseneimpingement

Summary

Vi presenterer en tilpasset eksperimentell plattform og vevskulturprotokoll som gjenskaper fibrokartilaginøs forandring drevet av impingement av akillesseninnsettingen i murine bakre lemmereksplanter med vedvarende cellelevedyktighet, og gir en modell som er egnet for å utforske mekanobiologien til senepåvirkning.

Abstract

Seneimpingement på bein genererer et multiaksialt mekanisk belastningsmiljø med markert forhøyet tverrgående kompresjonsstamme, som fremkaller en lokalisert fibrobruskfenotype karakterisert ved akkumulering av glykosaminoglykan (GAG) -rik matrise og remodellering av kollagennettverket. Mens fibrobrusk er en normal funksjon i impinged områder av sunne sener, er overflødig GAG-avsetning og uorganisering av kollagennettverket kjennetegn ved tendinopati. Følgelig er impingement klinisk anerkjent som en viktig ekstrinsisk faktor i initiering og progresjon av tendinopati. Likevel er den mekanobiologiske underliggende seneimpingement fortsatt understudert. Tidligere forsøk på å belyse cellulær respons på seneimpingement har anvendt uniaxial kompresjon på celler og utskårne seneplanter in vitro. Imidlertid mangler isolerte celler et tredimensjonalt ekstracellulært miljø som er avgjørende for mekanorespons, og både in vitro og utskårne eksplantstudier klarer ikke å rekapitulere det multiaksiale belastningsmiljøet generert av seneimpingement in vivo, som avhenger av anatomiske trekk i det impingede området. Videre mangler in vivo-modeller av seneimpingement kontroll over det mekaniske belastningsmiljøet. For å overvinne disse begrensningene presenterer vi en ny murine hind limb explant-modell egnet for å studere mekanobiologien til akillessenimpingement. Denne modellen opprettholder akillessenen in situ for å bevare lokal anatomi og reproduserer det multiaksiale belastningsmiljøet som genereres ved impingement av akillessenens innsetting på calcaneus under passivt påført ankeldorsifleksjon mens de beholder celler i sitt opprinnelige miljø. Vi beskriver en vevskulturprotokoll integrert i denne modellen og presenterer data som etablerer vedvarende eksplanteringsdyktighet over 7 dager. De representative resultatene viser forbedret histologisk GAG-farging og redusert kollagenfiberjustering sekundært til impingement, noe som tyder på forhøyet fibrobruskdannelse. Denne modellen kan enkelt tilpasses for å undersøke forskjellige mekaniske belastningsregimer og muliggjør manipulering av molekylære veier av interesse for å identifisere mekanismer som medierer fenotypisk endring i akillessenen som respons på impingement.

Introduction

En rekke sener, inkludert akillessenen og senene i rotatormansjetten, opplever benete impingement på grunn av normal anatomisk posisjonering^1,2,3,4. Seneimpingement genererer trykkbelastning rettet på tvers av den langsgående fiberaksen^5,6,7. Regioner med senepåvirkning demonstrerer en unik fibrobruskfenotype der krympede, runde celler (fibrokondrocytter) er innebygd i et uorganisert kollagennettverk med markert økt glykosaminoglykan (GAG) innhold^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Tidligere studier tyder på at det uensartede mekaniske miljøet produsert av seneimpingement opprettholder denne GAG-rike matrisen ved å drive avsetningen av store aggregerende proteoglykaner, spesielt aggrekanske, selv om de underliggende mekanismene er uklare^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Mens fibrokartilje er en normal funksjon i impinged områder av sunne sener, avvikende proteoglykan metabolisme assosiert med overdreven fibrocartilage formasjon er et kjennetegn trekk ved tendinopati, en vanlig og svekkende sykdom som uforholdsmessig oppstår i kronisk impinged sener^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Følgelig er seneimpingement klinisk anerkjent som en viktig ytre faktor som driver flere av de vanligste tendinopatiene, inkludert rotatormansjettsykdom og innsettingsakillestendinopati (IAT)^50,51,52. For tiden er behandling av tendinopati ineffektiv. For eksempel trenger ca. 47 % av pasientene med IAT kirurgisk inngrep etter mislykket konservativ behandling, med varierende postoperative utfall^53,54,55,56. Til tross for den tilsynelatende sammenhengen mellom impingement og tendinopati, er de mekanobiologiske mekanismene som celler i impinged senesans og reagerer på deres mekaniske miljø dårlig beskrevet, noe som tilslører forståelsen av tendinopati patogenese og resulterer i utilstrekkelig behandling.

Explant-modeller er nyttige verktøy i studiet av senemekanobiologi^57,58. Som et første skritt mot å forstå mekanobiologien til seneimpingement, har flere tidligere studier utforsket cellulær respons etter påføring av enkel uniaxial kompresjon til celler eller utskårne seneplanter 27,29,30,31,32,33,34,39. Imidlertid mangler celler in vitro ekstracellulære og pericellulære matriser som letter belastningsoverføring, sekvestrerer viktige vekstfaktorer og cytokiner frigjort ved mekanisk deformasjon, og gir substrat for fokaladhesjonskomplekser som spiller en rolle i mekanotransduksjon^57,59. I tillegg klarer både in vitro og utskårne eksplantstudier ikke å rekapitulere det multiaksiale mekaniske belastningsmiljøet generert av seneimpingement in vivo, som avhenger av anatomiske trekk i den impinged region ^5,6. I sammenheng med den impinged akillessenen innsetting, inkluderer dette omkringliggende vev som retrocalcaneal bursa og Kager’s fett pad 60,61,62,63. Omvendt tillater in vivo-modeller av seneimpingement 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontroll over størrelsen og frekvensen av belastningen som påføres direkte på senen, noe som er en velkjent begrensning av in vivo-modeller for å studere senemekanobiologi ^57,58,67,68,69,70. Gitt utfordringer med å måle senebelastning in vivo, er det indre belastningsmiljøet som genereres i disse modellene ofte dårlig karakterisert.

I dette manuskriptet presenterer vi en tilpasset eksperimentell plattform som gjenskaper impingement av akillessenens innsetting på calcaneus i hele murine baklem eksplanter som, når de er parret med denne vevskulturprotokollen, opprettholder levedyktighet over 7 dager i eksplantkultur og muliggjør studier av de biologiske følgene av senepåvirkning. Plattformen er bygget på en 3D-printet polylaktinsyre (PLA) base som gir grunnlaget for festing av grepene og 3D-trykt PLA volumreduksjonsinnsats. Grepene brukes til å klemme overbenet og kneet proksimalt til akillesens myotendinøse overgang med det kaudale aspektet av bakbenet vendt oppover, slik at akillessenen kan avbildes ovenfra ved hjelp av ultralydsonde eller invertert mikroskop (figur 1A). Volumreduksjonen setter inn lysbilder langs et spor på basen og reduserer det nødvendige volumet av vevskulturmedier. En flettet linje viklet rundt bakpoten rutes ut av plattformen ved hjelp av basisdesignet og et 3D-trykt PLA-klipp. Ved å trekke i strengen dorsibøyes bakpoten, og akillesseninnføringen støtes mot calcaneus, noe som resulterer i forhøyet tverrgående trykkbelastning ^5,6 (figur 1A). Plattformen er inneholdt i et akrylbad som opprettholder bakbenets eksplanter nedsenket i vevskulturmedier. Sikring av den stramme strengen på utsiden av badekaret med tape opprettholder ankeldorsifleksjon for å produsere statisk impingement av akillesseninnsettingen. CAD-filer for 3D-printede komponenter leveres i flere formater (tilleggsfil 1), slik at de kan importeres til en rekke kommersielle og gratis CAD-programvare med åpen kildekode for modifisering for å dekke eksperimentelle behov. Hvis tilgang til 3D-skrivere ikke er tilgjengelig for fabrikasjon, kan CAD-filer leveres til online 3D-utskriftstjenester som vil skrive ut og sende delene til lave kostnader.

Det er viktig å merke seg at triceps surae-Achilles muskulotendinøse kompleks spenner over både kne- og ankelleddene 71,72,73. Følgelig påvirkes strekkbelastningen i akillessenen av knefleksjon. Kneforlengelse setter akillessenen under spenning, mens knefleksjon reduserer spenningen. Ved først å forlenge kneet og deretter passivt dorsibøye ankelen, kan kompresjonsbelastninger ved den hindrede innføringen legges over strekkbelastninger. Omvendt, ved passiv dorsiflexing ankelen med kneet bøyd, reduseres strekkbelastningen, og trykkbelastning forblir. Den nåværende protokollen utforsker tre slike forhold. 1) For statisk impingement dorsiflexes foten til < 110° i forhold til tibia for å hindre innføringen, med kneet bøyd for å redusere spenningen. 2) For baseline spenningsgruppen forlenges ankelen over 145° av dorsifleksjon med kneet forlenget, noe som hovedsakelig genererer strekkbelastning ved innføringen. 3) For den lossede gruppen dyrkes eksplanter i en petriskål med kne og ankel i nøytrale stillinger i fravær av eksternt påført belastning. Vinklene nevnt ovenfor er fotografisk målt i forhold til et koordinatsystem der foten og tibia er parallelle i en vinkel på 180° og vinkelrett i en vinkel på 90°.

Viktige trinn i protokollen inkluderer 1) disseksjon av bakre lemmer explants og forsiktig fjerning av huden og plantaris senen; 2) eksplantekultur etter en 48 timers deksametason forbehandling; 3) vevsseksjonering og histologisk farging; og 4) fargebildeanalyse for å vurdere fibrobruskdannelse. Etter disseksjon forbehandles hver bakkroppseksplantasjon i 48 timer i dyrkningsmedier supplert med deksametason⁷⁴. Kontralaterale lemmer fra hver mus er tildelt separate eksperimentelle grupper for parvis sammenligning, noe som bidrar til å kontrollere biologisk variabilitet. Etter forbehandling plasseres eksplantene i plattformer som beskrevet ovenfor og dyrkes i ytterligere 7 dager (figur 1B). Ytterligere sammenligninger gjøres med en forbehandlet (dag 0) gruppe der eksplanter fjernes umiddelbart etter 48 timers forbehandling.

Etter eksplantkultur blir bakre lemmer trimmet ned, formalin fast, avkalket og innebygd i paraffin. Seriesnitt i sagittal orientering gir visualisering av akillessenen fra det myotendinøse overgangen til kalkinnføringen, samtidig som snittdybden kan spores gjennom hele senen. Terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT)-mediert dUTP X-nick-merking (TUNEL) brukes til å visualisere DNA-skade sekundært til apoptose og vurdere levedyktighet. Toluidinblå histologi og tilpasset fargebildeanalyse utføres for å kvantifisere endringer i GAG-farging. Toluidinblåfargede vevsseksjoner brukes deretter til SHG-avbildning for å karakterisere endringer i collagefiberorganisasjon (figur 1B).

De oppgitte representative resultatene antyder endret histologisk farging av den GAG-rike matrisen og desorganisering av det ekstracellulære kollagennettverket generert av 7 dager med statisk impingement i modellen. Denne modellen kan brukes til å utforske molekylære mekanismer som ligger til grunn for impingement-drevet fibrocartilaginous forandring.

Protocol

Alt dyrearbeid ble godkjent av University of Rochester Committee on Animal Resources. 1. Fremstilling av vevskulturmedier Dyrkning alle eksplanterer i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (1x DMEM) med 1% v/v penicillin-streptomycin og 200 μM L-askorbinsyre i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. For de første 48 timers forbehandlingen dyrket hver plante i 70 ml kulturmedier supplert med 100 nM deksametason74. Etter forbehandling, kultu…

Representative Results

Representative bilder av TUNEL-fargede vevssnitt viser minimalt med apoptotiske kjerner i kroppen av akillessenen etter 7 dager med eksplantkultur på tvers av eksperimentelle grupper (figur 2A). Kvantifisering av disse bildene gir holdepunkter for at vevskulturprotokollen opprettholder opptil 78 % levedyktighet i gjennomsnitt i akillessenen etter 7 dager med eksplantdyrkning på tvers av belastningsforhold (figur 2B). Kvalitativt er …

Discussion

Den eksperimentelle murine bakre lem explant-plattformen sammen med vevskulturprotokollen beskrevet i denne studien gir en egnet modell for å studere mekanobiologien til impingementdrevet fibrobruskdannelse ved akillesseninnsettingen. Nytten av denne eksplanteringsmodellen er demonstrert av de representative resultatene, som indikerer vedlikehold av cellelevedyktighet samtidig med signifikant og romlig heterogen forandring i toluidinblå farging etter 7 dager med statisk impingement. Disse funnene antyder endret metabol…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining