Мы представляем индивидуальную экспериментальную платформу и протокол культивирования тканей, которые воссоздают фиброзно-хрящевые изменения, вызванные импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия в эксплантатах задних конечностей мышей с устойчивой жизнеспособностью клеток, предоставляя модель, подходящую для изучения механобиологии импинджмента сухожилий.
Соприкосновение сухожилия с костью создает многоосную механическую деформационную среду с заметно повышенной поперечной сжимающей деформацией, что вызывает локализованный фенотип фиброзного хряща, характеризующийся накоплением богатого гликозаминогликаном (ГАГ) матрикса и ремоделированием коллагеновой сети. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, избыточное отложение ГАГ и дезорганизация коллагеновой сети являются отличительными признаками тендинопатии. Соответственно, импинджмент клинически признан важным внешним фактором в инициации и прогрессировании тендинопатии. Тем не менее, механобиология, лежащая в основе импинджмента сухожилий, остается недостаточно изученной. В предыдущих попытках выяснить клеточный ответ на импинджмент сухожилий применялась одноосная компрессия к клеткам и иссеченные экспланты сухожилий in vitro. Тем не менее, изолированным клеткам не хватает трехмерной внеклеточной среды, имеющей решающее значение для механореакции, и как в исследованиях in vitro , так и в исследованиях эксплантов не удается повторить многоосную напряженную среду, генерируемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области. Более того, в моделях соударения сухожилий in vivo отсутствует контроль над средой механической деформации. Для преодоления этих ограничений мы представляем новую модель эксплантата задней конечности мыши, пригодную для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия. Эта модель поддерживает ахиллово сухожилие in situ для сохранения локальной анатомии и воспроизводит многоосную деформационную среду, создаваемую импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости во время пассивного тыльного сгибания голеностопного сустава, сохраняя клетки в их родной среде. Мы описываем протокол культивирования тканей, неотъемлемый от этой модели, и представляем данные, устанавливающие устойчивую жизнеспособность эксплантата в течение 7 дней. Репрезентативные результаты демонстрируют усиленное гистологическое окрашивание ГАГ и снижение выравнивания коллагеновых волокон на фоне импинджмента, что указывает на повышенное образование фиброзно-хрящевой ткани. Эта модель может быть легко адаптирована для исследования различных режимов механического нагружения и позволяет манипулировать интересующими молекулярными путями для выявления механизмов, опосредующих фенотипические изменения в ахилловом сухожилии в ответ на импинджмент.
Множество сухожилий, включая сухожилие ахиллова сухожилия и сухожилия вращательной манжеты плеча, испытывают костный импинджмент из-за нормального анатомического положения1,2,3,4. Соударение сухожилий создает сжимающую нагрузку, направленную поперек продольной оси волокон5,6,7. Области импинджмента сухожилий демонстрируют уникальный фенотип фиброзного хряща, в котором сморщенные круглые клетки (фиброзхондроциты) встроены в дезорганизованную коллагеновую сеть с заметно повышенным содержанием гликозаминогликанов (ГАГ)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Предыдущие исследования показывают, что несопоставимая механическая среда, создаваемая соударением сухожилий, поддерживает эту богатую GAG матрицу, стимулируя отложение крупных агрегирующих протеогликанов, в первую очередь аггрекана, хотя лежащие в их основе механизмы неясны1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, аберрантный метаболизм протеогликанов, связанный с чрезмерным образованием фиброзно-хрящевой ткани, является отличительной чертой тендинопатии, распространенного и изнурительного заболевания, которое непропорционально проявляется в хронически ущемленных сухожилиях1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Соответственно, импинджмент сухожилий клинически признан важным внешним фактором, приводящим к нескольким наиболее распространенным тендинопатиям, включая болезнь вращательной манжеты плеча и инсерционную тендинопатию ахиллова сухожилия (IAT)50,51,52. В настоящее время лечение тендинопатии неэффективно. Например, примерно 47% пациентов с ИАТ нуждаются в хирургическом вмешательстве после неудачного консервативного лечения с различными послеоперационными исходами53,54,55,56. Несмотря на очевидную связь между импинджментом и тендинопатией, механобиологические механизмы, с помощью которых клетки в ущемленном сухожилии чувствуют и реагируют на свою механическую среду, плохо описаны, что затрудняет понимание патогенеза тендинопатии и приводит к неадекватному лечению.
Эксплантированные модели являются полезными инструментами при изучении механобиологии сухожилий57,58. В качестве первого шага к пониманию механобиологии импинджмента сухожилий в нескольких предыдущих исследованиях изучался клеточный ответ после применения простой одноосной компрессии к клеткам или эксплантированным эксплантам сухожилий 27,29,30,31,32,33,34,39. Однако в клетках in vitro отсутствуют внеклеточные и перицеллюлярные матрицы, которые облегчают перенос деформации, связывают важные факторы роста и цитокины, высвобождаемые при механической деформации, и обеспечивают субстрат для комплексов фокальной адгезии, которые играют роль в механотрансдукции57,59. Кроме того, как в исследованиях in vitro, так и в исследованиях эксплантов не удалось повторить многоосную механическую деформационную среду, создаваемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области 5,6. В контексте ущемления ахиллова сухожилия это включает окружающие ткани, такие как запяточная синовиальная сумка и жировая подушкаКагера 60,61,62,63. И наоборот, in vivo модели соприкосновения сухожилий 25,28,36,37,38,64,65,66 позволяют осуществлять минимальный контроль над величиной и частотой нагрузки, прикладываемой непосредственно к сухожилию, что является общепризнанным ограничением моделей in vivo для изучения механобиологии сухожилий57,58,67,68,69,70. Учитывая трудности измерения деформации сухожилий in vivo, внутренняя напряженная среда, создаваемая в этих моделях, часто плохо характеризуется.
В этой рукописи мы представляем специальную экспериментальную платформу, которая воссоздает импинджмент прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости внутри целых эксплантов задних конечностей мыши, что в сочетании с этим протоколом культивирования тканей сохраняет жизнеспособность в течение 7 дней в культуре эксплантов и позволяет изучать биологические последствия импинджмента сухожилий. Платформа построена на основе полимолочной кислоты (PLA), напечатанной на 3D-принтере, которая обеспечивает основу для крепления захватов и напечатанной на 3D-принтере вставки для уменьшения объема PLA. Захваты используются для зажима верхней части голени и колена проксимальнее миотендовидного соединения ахиллова сухожилия с каудальной стороной задней конечности, обращенной вверх, что позволяет визуализировать ахиллово сухожилие сверху с помощью ультразвукового датчика или инвертированного микроскопа (рис. 1А). Вкладыш для уменьшения объема скользит по дорожке на основании и уменьшает необходимый объем среды для культивирования тканей. Плетеная леска, обернутая вокруг задней лапы, выводится из платформы с использованием базовой конструкции и зажима из PLA, напечатанного на 3D-принтере. При натяжении тетиви задняя лапа сгибается, и прикрепление ахиллова сухожилия упирается в пяточную кость, что приводит к повышенной поперечной сжимающей деформации 5,6 (рис. 1А). Платформа находится в акриловой ванне, в которой эксплантаты задних конечностей погружаются в питательную среду для тканей. Крепление натянутой струны к внешней стороне ванны с помощью клейкой ленты поддерживает тыльное сгибание голеностопного сустава, вызывая статическое соприкосновение прикрепления ахиллова сухожилия. Файлы САПР для компонентов, напечатанных на 3D-принтере, предоставляются в нескольких форматах (Дополнительный файл 1), что позволяет импортировать их в ряд коммерческих и бесплатных программ САПР с открытым исходным кодом для модификации в соответствии с экспериментальными потребностями. Если доступ к 3D-принтерам недоступен для изготовления, файлы САПР могут быть предоставлены онлайн-сервисам 3D-печати, которые напечатают и отправят детали по низкой цене.
Важно отметить, что трехглаво-ахиллово мышечно-ахиллово соединение охватывает как коленный, так и голеностопный суставы 71,72,73. Следовательно, растяжение ахиллова сухожилия зависит от сгибания колена. Разгибание колена напрягает ахиллово сухожилие, в то время как сгибание колена уменьшает напряжение. Сначала разгибая колено, а затем пассивно сгибая голеностопный сустав, можно наложить компрессионные нагрузки в месте ущемления на растягивающие напряжения. И наоборот, при пассивном тыльном сгибании голеностопного сустава при согнутом колене растягивающее напряжение уменьшается, а сжимающее напряжение сохраняется. В настоящем протоколе рассматриваются три таких состояния. 1) При статическом импинджменте стопа сгибается на < 110° по отношению к большеберцовой кости, чтобы соприкоснуться с местом присоединения, при этом колено сгибается для уменьшения напряжения. 2) В группе исходного напряжения голеностопный сустав вытягивается на 145° тыльного сгибания, а колено вытянуто, создавая преимущественно растягивающее напряжение в месте введения. 3) Для разгруженной группы экспланты культивируют в чашке Петри с коленом и голеностопом в нейтральном положении при отсутствии внешней нагрузки. Углы, упомянутые выше, фотографически измеряются относительно системы координат, в которой стопа и большеберцовая кости параллельны под углом 180° и перпендикулярны под углом 90°.
Ключевые этапы протокола включают: 1) рассечение эксплантов задних конечностей и тщательное удаление кожи и подошвенного сухожилия; 2) эксплантировать культуру после 48-часовой предварительной обработки дексаметазоном; 3) срез тканей и гистологическое окрашивание; 4) анализ цветного изображения для оценки формирования фиброзно-хрящевой ткани. После диссекции каждый эксплант задней конечности предварительно обрабатывают в течение 48 ч в питательной среде с добавлением дексаметазона74. Контралатеральные конечности каждой мыши распределяются по отдельным экспериментальным группам для попарного сравнения, что помогает контролировать биологическую изменчивость. После предварительной обработки экспланты помещают на платформы, как описано выше, и культивируют еще 7 дней (рис. 1B). Дополнительные сравнения были проведены с группой, получавшей предварительную обработку (день 0), в которой эксплантаты удалялись сразу после 48-часовой предварительной обработки.
После эксплантации культуры задние конечности обрезают, формалин фиксируют, декальцинируют и заделывают в парафин. Последовательный срез в сагиттальной ориентации обеспечивает визуализацию ахиллова сухожилия от миотендинозного соединения до пяточной вставки, позволяя отслеживать глубину сечения по всему сухожилию. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансферазное (TdT)-опосредованное мечение dUTP X-ника (TUNEL) используется для визуализации повреждений ДНК на фоне апоптоза и оценки жизнеспособности. Гистология толуидинового синего и анализ пользовательских цветных изображений проводятся для количественной оценки изменений в окрашивании ГАГ. Затем срезы тканей, окрашенные толуидиновым синим, затем используются для визуализации ГВГ, чтобы охарактеризовать изменения в организации коллагеновых волокон (рис. 1B).
Представленные репрезентативные результаты свидетельствуют об измененном гистологическом окрашивании богатого ГАГ матрикса и дезорганизации внеклеточной коллагеновой сети, генерируемой 7-дневным статическим импинджментом в пределах модели. Эта модель может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе фиброзно-хрящевых изменений, вызванных импинджментом.
Экспериментальная платформа эксплантата задних конечностей мыши в сочетании с протоколом культивирования тканей, описанным в этом исследовании, обеспечивает подходящую модель для изучения механобиологии формирования фиброзно-хрящевого хряща, вызванного импинджментом в месте прик?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны за поддержку и помощь, оказанную Джеффом Фоксом и Видьей Венкатрамани из Центра исследований опорно-двигательного аппарата Центра исследований опорно-двигательного аппарата (HBMI), частично финансируемого P30AR06965. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Центр световой микроскопии и наноскопии (CALMN) при Медицинском центре Университета Рочестера за помощь в проведении многофотонной микроскопии. Это исследование финансировалось R01 AR070765 и R01 AR070765-04S1, а также 1R35GM147054 и 1R01AR082349.
Absorbent underpads | VWR | 82020-845 | For benchtop dissection |
Acrylic bath | Source One | X001G46CB1 | Contains the explant platform submerged in culture media |
Autoclave bin | Thermo Scientific | 13-361-20 | Used as secondary containment, holds two platforms |
Base | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Braided line | KastKing | 30lb test | Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion |
Clip | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Cover glass | Fisherbrand | 12-541-034 | Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm |
Cytoseal XYL | VWR | 8312-4 | Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections |
Dexamethasone | MP Biomedical LLC | 194561 | CAS#50-02-2 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Invitrogen by ThermoFisher | D12345 | CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions |
Double-sided tape | Scotch Brand | 34-8724-5195-9 | To attach sandpaper to Grip platens |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) | Gibco by ThermoFisher | 11965092 | high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine |
EDTA tetrasodium salt dihydrate | Thermo Scientific Chemicals | J15700.A1 | CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation |
Ethanol, 200 proof | Thermo Scientific | T038181000 | CAS#64-17-5, 1 L supply |
Foam biopsy pads | Leica | 3801000 | Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification |
Forceps, #SS Standard Inox | Dumont | 11203-23 | Straight, smooth, fine tips |
Forceps, Micro-Adson 4.75" | Fisherbrand | 13-820-073 | Straight, fine tips with serrated teeth |
Garnet Sandpaper, 50-D Grit | Norton | M600060 01518 | Or other coarse grit sandpaper |
Glacial acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution |
Grips | ADMET | GV-100NT-A4 | Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included |
Histobond Adhesive Microscope Slides | VWR | 16005-108 | Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols |
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
Labeling tape | Fisherbrand | 15-959 | Or any other labeling tape of preference |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | CAS#50-81-7, for culture media formulation |
Neutral buffered formalin, 10% | Leica | 3800600 | For sample fixation, 5 gallon supply |
Nunc petri dishes | Sigma-Aldrich | P7741-1CS | 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol |
Penicillin-streptomycin (100X) | Gibco by ThermoFisher | 15140122 | Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration |
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament | Hatchbox | – | Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice. |
Processing cassettes | Leica | 3802631 | For fixation, decalcification and paraffin embedding |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen by ThermoFisher | P36931 | Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL |
Proteinase K | Fisher BioReagents | BP1700-50 | CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol |
Scissors, Fine | FST | 14094-11 | Straight, sharp |
Slide Staining Set, 12-place | Mercedes Scientific | MER 1011 | Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology |
Sodium acetate, anhydrous | Thermo Scientific Chemicals | A1318430 | CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades | VWR | 25608-964 | For paraffin sectioning |
Toluidine Blue O | Thermo Scientific Chemicals | 348601000 | CAS#92-31-9 |
Volume Reduction Insert | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
Xylenes | Leica | 3803665 | 4 gallon supply for histological staining |