Модель эксплантата задней конечности мыши для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия

Summary

Мы представляем индивидуальную экспериментальную платформу и протокол культивирования тканей, которые воссоздают фиброзно-хрящевые изменения, вызванные импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия в эксплантатах задних конечностей мышей с устойчивой жизнеспособностью клеток, предоставляя модель, подходящую для изучения механобиологии импинджмента сухожилий.

Abstract

Соприкосновение сухожилия с костью создает многоосную механическую деформационную среду с заметно повышенной поперечной сжимающей деформацией, что вызывает локализованный фенотип фиброзного хряща, характеризующийся накоплением богатого гликозаминогликаном (ГАГ) матрикса и ремоделированием коллагеновой сети. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, избыточное отложение ГАГ и дезорганизация коллагеновой сети являются отличительными признаками тендинопатии. Соответственно, импинджмент клинически признан важным внешним фактором в инициации и прогрессировании тендинопатии. Тем не менее, механобиология, лежащая в основе импинджмента сухожилий, остается недостаточно изученной. В предыдущих попытках выяснить клеточный ответ на импинджмент сухожилий применялась одноосная компрессия к клеткам и иссеченные экспланты сухожилий in vitro. Тем не менее, изолированным клеткам не хватает трехмерной внеклеточной среды, имеющей решающее значение для механореакции, и как в исследованиях in vitro , так и в исследованиях эксплантов не удается повторить многоосную напряженную среду, генерируемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области. Более того, в моделях соударения сухожилий in vivo отсутствует контроль над средой механической деформации. Для преодоления этих ограничений мы представляем новую модель эксплантата задней конечности мыши, пригодную для изучения механобиологии импинджмента ахиллова сухожилия. Эта модель поддерживает ахиллово сухожилие in situ для сохранения локальной анатомии и воспроизводит многоосную деформационную среду, создаваемую импинджментом прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости во время пассивного тыльного сгибания голеностопного сустава, сохраняя клетки в их родной среде. Мы описываем протокол культивирования тканей, неотъемлемый от этой модели, и представляем данные, устанавливающие устойчивую жизнеспособность эксплантата в течение 7 дней. Репрезентативные результаты демонстрируют усиленное гистологическое окрашивание ГАГ и снижение выравнивания коллагеновых волокон на фоне импинджмента, что указывает на повышенное образование фиброзно-хрящевой ткани. Эта модель может быть легко адаптирована для исследования различных режимов механического нагружения и позволяет манипулировать интересующими молекулярными путями для выявления механизмов, опосредующих фенотипические изменения в ахилловом сухожилии в ответ на импинджмент.

Introduction

Множество сухожилий, включая сухожилие ахиллова сухожилия и сухожилия вращательной манжеты плеча, испытывают костный импинджмент из-за нормального анатомического положения^1,2,3,4. Соударение сухожилий создает сжимающую нагрузку, направленную поперек продольной оси волокон^5,6,7. Области импинджмента сухожилий демонстрируют уникальный фенотип фиброзного хряща, в котором сморщенные круглые клетки (фиброзхондроциты) встроены в дезорганизованную коллагеновую сеть с заметно повышенным содержанием гликозаминогликанов (ГАГ)^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Предыдущие исследования показывают, что несопоставимая механическая среда, создаваемая соударением сухожилий, поддерживает эту богатую GAG матрицу, стимулируя отложение крупных агрегирующих протеогликанов, в первую очередь аггрекана, хотя лежащие в их основе механизмы неясны^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. В то время как фиброзно-хрящевая ткань является нормальным признаком в ущемленных областях здоровых сухожилий, аберрантный метаболизм протеогликанов, связанный с чрезмерным образованием фиброзно-хрящевой ткани, является отличительной чертой тендинопатии, распространенного и изнурительного заболевания, которое непропорционально проявляется в хронически ущемленных сухожилиях^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Соответственно, импинджмент сухожилий клинически признан важным внешним фактором, приводящим к нескольким наиболее распространенным тендинопатиям, включая болезнь вращательной манжеты плеча и инсерционную тендинопатию ахиллова сухожилия (IAT)^50,51,52. В настоящее время лечение тендинопатии неэффективно. Например, примерно 47% пациентов с ИАТ нуждаются в хирургическом вмешательстве после неудачного консервативного лечения с различными послеоперационными исходами^53,54,55,56. Несмотря на очевидную связь между импинджментом и тендинопатией, механобиологические механизмы, с помощью которых клетки в ущемленном сухожилии чувствуют и реагируют на свою механическую среду, плохо описаны, что затрудняет понимание патогенеза тендинопатии и приводит к неадекватному лечению.

Эксплантированные модели являются полезными инструментами при изучении механобиологии сухожилий^57,58. В качестве первого шага к пониманию механобиологии импинджмента сухожилий в нескольких предыдущих исследованиях изучался клеточный ответ после применения простой одноосной компрессии к клеткам или эксплантированным эксплантам сухожилий 27,29,30,31,32,33,34,39. Однако в клетках in vitro отсутствуют внеклеточные и перицеллюлярные матрицы, которые облегчают перенос деформации, связывают важные факторы роста и цитокины, высвобождаемые при механической деформации, и обеспечивают субстрат для комплексов фокальной адгезии, которые играют роль в механотрансдукции^57,59. Кроме того, как в исследованиях in vitro, так и в исследованиях эксплантов не удалось повторить многоосную механическую деформационную среду, создаваемую импинджментом сухожилий in vivo, которая зависит от анатомических особенностей ущемленной области ^5,6. В контексте ущемления ахиллова сухожилия это включает окружающие ткани, такие как запяточная синовиальная сумка и жировая подушка^Кагера 60,61,62,63. И наоборот, in vivo модели соприкосновения сухожилий 25,28,36,37,38,64,65,66 позволяют осуществлять минимальный контроль над величиной и частотой нагрузки, прикладываемой непосредственно к сухожилию, что является общепризнанным ограничением моделей in vivo для изучения механобиологии сухожилий^57,58,67,68,69,70. Учитывая трудности измерения деформации сухожилий in vivo, внутренняя напряженная среда, создаваемая в этих моделях, часто плохо характеризуется.

В этой рукописи мы представляем специальную экспериментальную платформу, которая воссоздает импинджмент прикрепления ахиллова сухожилия к пяточной кости внутри целых эксплантов задних конечностей мыши, что в сочетании с этим протоколом культивирования тканей сохраняет жизнеспособность в течение 7 дней в культуре эксплантов и позволяет изучать биологические последствия импинджмента сухожилий. Платформа построена на основе полимолочной кислоты (PLA), напечатанной на 3D-принтере, которая обеспечивает основу для крепления захватов и напечатанной на 3D-принтере вставки для уменьшения объема PLA. Захваты используются для зажима верхней части голени и колена проксимальнее миотендовидного соединения ахиллова сухожилия с каудальной стороной задней конечности, обращенной вверх, что позволяет визуализировать ахиллово сухожилие сверху с помощью ультразвукового датчика или инвертированного микроскопа (рис. 1А). Вкладыш для уменьшения объема скользит по дорожке на основании и уменьшает необходимый объем среды для культивирования тканей. Плетеная леска, обернутая вокруг задней лапы, выводится из платформы с использованием базовой конструкции и зажима из PLA, напечатанного на 3D-принтере. При натяжении тетиви задняя лапа сгибается, и прикрепление ахиллова сухожилия упирается в пяточную кость, что приводит к повышенной поперечной сжимающей деформации ^5,6 (рис. 1А). Платформа находится в акриловой ванне, в которой эксплантаты задних конечностей погружаются в питательную среду для тканей. Крепление натянутой струны к внешней стороне ванны с помощью клейкой ленты поддерживает тыльное сгибание голеностопного сустава, вызывая статическое соприкосновение прикрепления ахиллова сухожилия. Файлы САПР для компонентов, напечатанных на 3D-принтере, предоставляются в нескольких форматах (Дополнительный файл 1), что позволяет импортировать их в ряд коммерческих и бесплатных программ САПР с открытым исходным кодом для модификации в соответствии с экспериментальными потребностями. Если доступ к 3D-принтерам недоступен для изготовления, файлы САПР могут быть предоставлены онлайн-сервисам 3D-печати, которые напечатают и отправят детали по низкой цене.

Важно отметить, что трехглаво-ахиллово мышечно-ахиллово соединение охватывает как коленный, так и голеностопный суставы 71,72,73. Следовательно, растяжение ахиллова сухожилия зависит от сгибания колена. Разгибание колена напрягает ахиллово сухожилие, в то время как сгибание колена уменьшает напряжение. Сначала разгибая колено, а затем пассивно сгибая голеностопный сустав, можно наложить компрессионные нагрузки в месте ущемления на растягивающие напряжения. И наоборот, при пассивном тыльном сгибании голеностопного сустава при согнутом колене растягивающее напряжение уменьшается, а сжимающее напряжение сохраняется. В настоящем протоколе рассматриваются три таких состояния. 1) При статическом импинджменте стопа сгибается на < 110° по отношению к большеберцовой кости, чтобы соприкоснуться с местом присоединения, при этом колено сгибается для уменьшения напряжения. 2) В группе исходного напряжения голеностопный сустав вытягивается на 145° тыльного сгибания, а колено вытянуто, создавая преимущественно растягивающее напряжение в месте введения. 3) Для разгруженной группы экспланты культивируют в чашке Петри с коленом и голеностопом в нейтральном положении при отсутствии внешней нагрузки. Углы, упомянутые выше, фотографически измеряются относительно системы координат, в которой стопа и большеберцовая кости параллельны под углом 180° и перпендикулярны под углом 90°.

Ключевые этапы протокола включают: 1) рассечение эксплантов задних конечностей и тщательное удаление кожи и подошвенного сухожилия; 2) эксплантировать культуру после 48-часовой предварительной обработки дексаметазоном; 3) срез тканей и гистологическое окрашивание; 4) анализ цветного изображения для оценки формирования фиброзно-хрящевой ткани. После диссекции каждый эксплант задней конечности предварительно обрабатывают в течение 48 ч в питательной среде с добавлением дексаметазона⁷⁴. Контралатеральные конечности каждой мыши распределяются по отдельным экспериментальным группам для попарного сравнения, что помогает контролировать биологическую изменчивость. После предварительной обработки экспланты помещают на платформы, как описано выше, и культивируют еще 7 дней (рис. 1B). Дополнительные сравнения были проведены с группой, получавшей предварительную обработку (день 0), в которой эксплантаты удалялись сразу после 48-часовой предварительной обработки.

После эксплантации культуры задние конечности обрезают, формалин фиксируют, декальцинируют и заделывают в парафин. Последовательный срез в сагиттальной ориентации обеспечивает визуализацию ахиллова сухожилия от миотендинозного соединения до пяточной вставки, позволяя отслеживать глубину сечения по всему сухожилию. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансферазное (TdT)-опосредованное мечение dUTP X-ника (TUNEL) используется для визуализации повреждений ДНК на фоне апоптоза и оценки жизнеспособности. Гистология толуидинового синего и анализ пользовательских цветных изображений проводятся для количественной оценки изменений в окрашивании ГАГ. Затем срезы тканей, окрашенные толуидиновым синим, затем используются для визуализации ГВГ, чтобы охарактеризовать изменения в организации коллагеновых волокон (рис. 1B).

Представленные репрезентативные результаты свидетельствуют об измененном гистологическом окрашивании богатого ГАГ матрикса и дезорганизации внеклеточной коллагеновой сети, генерируемой 7-дневным статическим импинджментом в пределах модели. Эта модель может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе фиброзно-хрящевых изменений, вызванных импинджментом.

Protocol

Все работы с животными были одобрены Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. 1. Подготовка питательных сред для тканей Культивирование всех эксплантов в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (1x DMEM) с 1% v/v пенициллина-стрептомицина и 200 мкМ L-аско…

Representative Results

Репрезентативные изображения срезов тканей, окрашенных методом TUNEL, демонстрируют минимальное количество апоптотических ядер в теле ахиллова сухожилия после 7 дней культивирования эксплантов в экспериментальных группах (рис. 2A). Количественная оценка этих изображени?…

Discussion

Экспериментальная платформа эксплантата задних конечностей мыши в сочетании с протоколом культивирования тканей, описанным в этом исследовании, обеспечивает подходящую модель для изучения механобиологии формирования фиброзно-хрящевого хряща, вызванного импинджментом в месте прик?…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining