Murin bakbensexplantationsmodell för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenan

Summary

Vi presenterar en anpassad experimentell plattform och vävnadsodlingsprotokoll som återskapar fibrobroskförändring som drivs av impingement av akillesseninsättningen i murina bakbensexplantor med bibehållen cellviabilitet, vilket ger en modell som är lämplig för att utforska mekanobiologin för senimpingement.

Abstract

Senpåverkan på ben genererar en multiaxiell mekanisk töjningsmiljö med markant förhöjd tvärgående trycktöjning, vilket framkallar en lokaliserad fibrobroskfenotyp som kännetecknas av ackumulering av glykosaminoglykan (GAG)-rik matris och ombyggnad av kollagennätverket. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i inträngda regioner av friska senor, är överskott av GAG-avsättning och desorganisation av kollagennätverket kännetecknande drag för tendinopati. Följaktligen är impingement kliniskt erkänd som en viktig yttre faktor vid initiering och progression av tendinopati. Ändå är den mekanobiologi som ligger till grund för senimpingement fortfarande understuderad. Tidigare försök att klarlägga det cellulära svaret på senimpingement har tillämpat enaxlig kompression på celler och exciderat senexplantation in vitro. Isolerade celler saknar dock en tredimensionell extracellulär miljö som är avgörande för mekanosvaret, och både in vitro – och excuterade explanteringsstudier misslyckas med att rekapitulera den fleraxliga töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos den inträngda regionen. Dessutom saknar in vivo-modeller av senimpingement kontroll över den mekaniska töjningsmiljön. För att övervinna dessa begränsningar presenterar vi en ny modell för explantation av bakbenen hos möss som är lämplig för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenor. Denna modell bibehåller akillessenan in situ för att bevara den lokala anatomin och reproducerar den multiaxiella töjningsmiljön som genereras av ingrepp i akillessenan på calcaneus under passivt applicerad fotledsdorsalflexion samtidigt som cellerna behålls i sin ursprungliga miljö. Vi beskriver ett vävnadsodlingsprotokoll som är integrerat i denna modell och presenterar data som fastställer bibehållen explantationsviabilitet under 7 dagar. De representativa resultaten visar förbättrad histologisk GAG-färgning och minskad kollagenfiberinriktning sekundärt till impingement, vilket tyder på förhöjd fibrobroskbildning. Denna modell kan enkelt anpassas för att undersöka olika mekaniska belastningsregimer och möjliggör manipulering av molekylära vägar av intresse för att identifiera mekanismer som medierar fenotypisk förändring i akillessenan som svar på impingement.

Introduction

En mängd senor, inklusive akillessenan och rotatorkuffsenorna, upplever benpåverkan på grund av normal anatomisk positionering^1,2,3,4. Klämning av senan genererar trycktöjning riktad tvärs mot den längsgående fiberaxeln^5,6,7. Regioner med senpåverkan visar en unik fibrobroskfenotyp där krympta, runda celler (fibrokondrocyter) är inbäddade i ett oorganiserat kollagennätverk med markant ökat innehåll av glykosaminoglykan (GAG)^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Tidigare studier tyder på att den olikartade mekaniska miljön som produceras av senimpingement upprätthåller denna GAG-rika matris genom att driva avsättningen av stora aggregerande proteoglykaner, framför allt aggrekan, även om de underliggande mekanismerna är oklara^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i påverkade regioner av friska senor, är avvikande proteoglykanmetabolism i samband med överdriven fibrobroskbildning ett kännetecken för tendinopati, en vanlig och försvagande sjukdom som oproportionerligt uppträder i kroniskt påverkade senor^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Följaktligen är senimpingement kliniskt erkänt som en viktig yttre faktor som driver flera av de vanligaste tendinopatierna, inklusive rotatorkuffsjukdom och insertionell akillestendinopati (IAT)^50,51,52. För närvarande är behandlingen av tendinopati ineffektiv. Till exempel behöver cirka 47 % av patienterna med IAT kirurgiskt ingrepp efter misslyckad konservativ behandling, med varierande postoperativa resultat^53,54,55,56. Trots det uppenbara sambandet mellan impingement och tendinopati är de mekanobiologiska mekanismerna genom vilka celler i impingerade senor känner av och svarar på sin mekaniska miljö dåligt beskrivna, vilket fördunklar förståelsen av tendinopatipatogenesen och resulterar i otillräcklig behandling.

Explantationsmodeller är användbara verktyg i studiet av senmekanobiologi^57,58. Som ett första steg mot att förstå mekanobiologin bakom senimpingement har flera tidigare studier undersökt cellulär respons efter applicering av enkel enaxlig kompression på celler eller exciderade senexplantationer 27,29,30,31,32,33,34,39. Celler in vitro saknar dock extracellulära och pericellulära matriser som underlättar stamöverföring, binder viktiga tillväxtfaktorer och cytokiner som frigörs genom mekanisk deformation och tillhandahåller substrat för fokala adhesionskomplex som spelar en roll i mekanotransduktion^57,59. Dessutom misslyckas både in vitro– och excised-explantationsstudier med att rekapitulera den fleraxliga mekaniska töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos det inträngda området ^5,6. I samband med den inträngda akillesseninsättningen inkluderar detta omgivande vävnader som retrocalcaneal bursa och Kagers fettkudde 60,61,62,63. Omvänt tillåter in vivo-modeller av senpåverkan 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontroll över storleken och frekvensen av belastning som appliceras direkt på senan, vilket är en välkänd begränsning av in vivo-modeller för att studera senans mekanobiologi^57,58,67,68,69,70. Med tanke på utmaningarna med att mäta senbelastning in vivo är den interna töjningsmiljön som genereras i dessa modeller ofta dåligt karakteriserad.

I detta manuskript presenterar vi en anpassad experimentell plattform som återskapar impingement av akillesseninsättningen på calcaneus i hela murina bakbensexplantor som, när de paras ihop med detta vävnadsodlingsprotokoll, bibehåller livskraften under 7 dagar i explanteringskultur och möjliggör studier av de biologiska följderna av senimpingement. Plattformen är byggd på en 3D-printad polymjölksyrabas (PLA) som utgör grunden för fastsättning av handtagen och 3D-printad PLA-volymreduceringsinsats. Greppen används för att klämma fast det övre benet och knäet proximalt mot akillessenan med den kaudala aspekten av bakbenet vänd uppåt, vilket gör att akillessenan kan avbildas ovanifrån med hjälp av en ultraljudssond eller inverterat mikroskop (Figur 1A). Volymreduceringsinsatsen glider längs ett spår på basen och minskar den erforderliga volymen vävnadsodlingsmedia. En flätad lina lindad runt baktassen dras ut ur plattformen med hjälp av basdesignen och en 3D-printad PLA-klämma. Genom att dra i snöret blir baktassen dorsalflexerad och akillessenan stöts mot calcaneus, vilket resulterar i förhöjd tvärgående trycktöjning ^5,6 (Figur 1A). Plattformen är innesluten i ett akrylbad som håller bakbensexplantorna nedsänkta i vävnadsodlingsmedia. Genom att fästa det spända snöret på utsidan av badet med tejp bibehålls fotledens dorsalflexion för att producera statisk impingement av akillesseninsättningen. CAD-filer för 3D-utskrivna komponenter tillhandahålls i flera format (tilläggsfil 1), vilket möjliggör import till en rad kommersiella och kostnadsfria CAD-program med öppen källkod för modifiering för att passa experimentella behov. Om tillgång till 3D-skrivare inte är tillgänglig för tillverkning kan CAD-filer tillhandahållas till 3D-utskriftstjänster online som skriver ut och skickar delarna till låg kostnad.

Viktigt är att triceps surae-Achilles muskulotendinösa komplex spänner över både knä- och fotlederna 71,72,73. Följaktligen påverkas dragbelastningen i akillessenan av knäböjningen. Knäförlängning sätter hälsenan under spänning, medan knäböjning minskar spänningen. Genom att först sträcka ut knäet och sedan passivt dorsiflexa fotleden kan kompressionsspänningar vid den inträngande insättningen överlagras på dragspänningar. Omvänt, genom att passivt dorsiflexera fotleden med knäet böjt, minskar dragbelastningen och tryckbelastningen kvarstår. I det nuvarande protokollet undersöks tre sådana villkor. 1) Vid statisk impingement är foten dorsalflexerad till < 110° i förhållande till skenbenet för att påverka insättningen, med knäet böjt för att minska spänningen. 2) För baslinjespänningsgruppen är fotleden utsträckt över 145° dorsalflexion med knäet utsträckt, vilket genererar övervägande dragbelastning vid insättningen. 3) För den obelastade gruppen odlas explantat i en petriskål med knä och fotled i neutrala positioner i frånvaro av externt applicerad belastning. Vinklarna som nämns ovan är fotografiskt uppmätta i förhållande till ett koordinatsystem där foten och skenbenet är parallella i en vinkel på 180° och vinkelräta i en vinkel på 90°.

Viktiga steg i protokollet inkluderar: 1) dissektion av bakbensexplantor och försiktigt avlägsnande av huden och plantarissenan; 2) explanteringsodling efter 48 timmars förbehandling med dexametason, 3) vävnadssnittning och histologisk färgning; och 4) färgbildsanalys för att bedöma fibrobroskbildning. Efter dissektion förbehandlas varje explantat av bakbenen i 48 timmar i odlingssubstrat kompletterat med dexametason⁷⁴. Kontralaterala lemmar från varje mus tilldelas separata experimentgrupper för parvis jämförelse, vilket hjälper till att kontrollera biologisk variabilitet. Efter förbehandlingen placeras explantaten i plattformar enligt beskrivningen ovan och odlas i ytterligare 7 dagar (figur 1B). Ytterligare jämförelser görs med en förbehandlad grupp (dag 0) där explantat avlägsnas omedelbart efter 48 timmars förbehandling.

Efter explantationsodling trimmas bakbenen ner, formalin fixeras, avkalkas och bäddas in i paraffin. Seriell snittning i sagittal orientering ger visualisering av akillessenan från den myoendentinösa övergången till calcanealinsättningen samtidigt som sektionsdjupet kan spåras genom hela senan. Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT)-medierad dUTP X-nick labeling (TUNEL) används för att visualisera DNA-skador sekundärt till apoptos och bedöma viabilitet. Toluidinblå histologi och anpassad färgbildsanalys utförs för att kvantifiera förändringar i GAG-färgning. Toluidinblåfärgade vävnadssnitt används sedan för SHG-avbildning för att karakterisera förändringar i collagefiberorganisationen (Figur 1B).

De tillhandahållna representativa resultaten tyder på förändrad histologisk färgning av den GAG-rika matrisen och desorganisation av det extracellulära kollagennätverket som genereras av 7 dagars statisk impingement i modellen. Denna modell kan användas för att utforska molekylära mekanismer som ligger till grund för impingement-driven fibrobroskförändring.

Protocol

Allt djurarbete godkändes av University of Rochester Committee on Animal Resources. 1. Beredning av vävnadsodlingsmedier Odla all explantat i Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x DMEM) med 1 % v/v penicillin-streptomycin och 200 μM L-askorbinsyra i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 . Under den inledande 48 timmar långa förbehandlingen odlas varje explantat i 70 ml odlingssubstrat kompletterat med 100 nM dexametason74. Efter f?…

Representative Results

Representativa bilder av TUNEL-färgade vävnadssnitt visar minimala apoptotiska kärnor i akillessenans kropp efter 7 dagars explanteringsodling i experimentgrupperna (Figur 2A). Kvantifiering av dessa bilder ger belägg för att vävnadsodlingsprotokollet bibehåller upp till 78 % livsduglighet i genomsnitt i akillessenan efter 7 dagars explanteringsodling under belastningsförhållanden (Figur 2B). Kvalitativt uppskattas förbättr…

Discussion

Den experimentella murina explanteringsplattformen i bakbenen i kombination med det vävnadsodlingsprotokoll som beskrivs i denna studie ger en lämplig modell för att studera mekanobiologin för impingementdriven fibrobroskbildning vid akillesseninsättningen. Användbarheten av denna explantationsmodell demonstreras av de representativa resultaten, som indikerar bibehållande av cellviabilitet samtidigt med betydande och rumsligt heterogen förändring i toluidinblå färgning efter 7 dagars statisk impingement. Dessa…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining