यह प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स और ग्लाइकोमिक्स सहित आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मानव जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के मानकीकृत संग्रह, एनोटेशन और बायोबैंकिंग के लिए एक एकीकृत बायोरिपोजिटरी प्लेटफॉर्म प्रस्तुत करता है।
ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण चुनौती ऑपरेटिंग रूम (ओआर) और अनुसंधान प्रयोगशाला में रोगी देखभाल के बीच एक व्यवहार्य और कुशल इंटरफ़ेस स्थापित कर रही है। यहां, हमने आंखों की सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से जलीय हास्य और विट्रस से आणविक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले तरल बायोप्सी प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस वर्कफ़्लो में, कंप्यूटर, बारकोड स्कैनर और ऑनबोर्ड कोल्ड स्टोरेज सहित लैब उपकरणों से लैस एक मोबाइल ऑपरेटिंग रूम लैब इंटरफ़ेस (एमओआरएलआई) कार्ट का उपयोग मानव जैविक नमूने प्राप्त करने और संग्रहीत करने के लिए किया जाता है। एक वेब-आधारित डेटा गोपनीयता-अनुरूप डेटाबेस प्रत्येक नमूने को उसके जीवनकाल में एनोटेट करने में सक्षम बनाता है, और एक कार्टेशियन समन्वय प्रणाली भंडारण में प्रत्येक बारकोडेड नमूने को ट्रैक करने की अनुमति देती है, जिससे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूनों की त्वरित और सटीक पुनर्प्राप्ति सक्षम होती है। मानव ऊतक के नमूनों का आणविक लक्षण वर्णन न केवल एक नैदानिक उपकरण के रूप में कार्य करता है (उदाहरण के लिए, संक्रामक एंडोफथाल्मिटिस और अन्य गैर-संक्रामक इंट्राओकुलर सूजन के बीच अंतर करने के लिए) बल्कि ट्रांसलेशनल अनुसंधान के एक महत्वपूर्ण घटक का भी प्रतिनिधित्व करता है, जिससे नए दवा लक्ष्यों की पहचान, नए नैदानिक उपकरणों के विकास और व्यक्तिगत चिकित्सीय की अनुमति मिलती है।
मानव आंख से तरल बायोप्सी की आणविक प्रोफाइलिंग डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, ग्लाइकेन्स और अत्यधिक विशिष्ट ओकुलर ऊतकों से मेटाबोलाइट्स जैसे अणुओं वाले स्थानीय रूप से समृद्ध तरल पदार्थों को पकड़ सकती है। मानव आंख के पीछे के कक्ष में विट्रियस से तरल बायोप्सी एक आम तौर परसुरक्षित प्रक्रिया साबित हुई। वे जीवित मनुष्यों में ओकुलर रोगों के आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं और 2,3,4 नई नैदानिक औरचिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने की क्षमता प्रदान करते हैं। आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में जलीय हास्य में और भी अधिक शल्य चिकित्सा पहुंच होती है और इसे बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी के दौरान, जो सबसे अधिक बार की जाने वाली सर्जरी में से एक है। हालांकि, प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स और ग्लाइकोमिक्स सहित आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मानव जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के संग्रह, एनोटेशन और बायोबैंकिंग के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल अब तक उपलब्ध नहीं है।
यहां, हमने आंखों की सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से आणविक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले तरल बायोप्सी के संग्रह और बायोबैंकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। एक मोबाइल ऑपरेटिंग रूम लैब इंटरफेस (एमओआरएलआई) एक शोधकर्ता को ऑपरेटिंग रूम (ओआर) में -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ पर बारकोडेड क्रायोवियल में एकत्र किए गए नमूनों को तुरंत स्नैप-फ्रीज करने में सक्षम बनाता है। यह प्रक्रिया डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण के लिए एक उच्च और सुसंगत नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करती है। उत्कृष्ट नमूना गुणवत्ता के अलावा, एक बायोबैंक में नमूनों की सटीक एनोटेशन महत्वपूर्ण है। वेब-आधारित HIPAA (स्वास्थ्य बीमा पोर्टेबिलिटी और जवाबदेही अधिनियम) -अनुरूप REDCap (अनुसंधान इलेक्ट्रॉनिक डेटा कैप्चर) डेटाबेस5 का उपयोग करते हुए, हमारा वर्कफ़्लो प्रत्येक नमूने के लिए विस्तृत मेटाडेटा के भंडारण की अनुमति देता है, जिसमें आयु, लिंग, बीमारी, रोग चरण, नमूना प्रकार और सर्जरी की अनूठी विशेषताएं शामिल हैं। यह सटीक भविष्य की खोज क्षमता की अनुमति देगा, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट बीमारी या रोगियों के एक विशेष समूह के नमूनों के लिए। इसके अलावा, फ्रीजर में प्रत्येक नमूने का सटीक स्थान कार्टेशियन ग्रिड सिस्टम का उपयोग करके संग्रहीत किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए कुशल नमूना पुनर्प्राप्ति को सक्षम बनाता है। हम डीएनए, प्रोटीन, ग्लाइकन और मेटाबोलाइट विश्लेषण के उदाहरण दिखाते हैं।
हमारा वर्कफ़्लो ओआर और अनुसंधान प्रयोगशाला के बीच एक व्यावहारिक और प्रभावी संबंध का प्रतिनिधित्व करता है और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान आधार प्रदान करता है।
रोगियों के सर्जिकल नमूनेजीवित मनुष्यों 2,3,4,14 में बीमारी के प्रत्यक्ष आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं, और सेल और पशु रोग मॉडल की सीमाओं को दूर करने में मदद कर सकते हैं जो मानव रोग 15,16 को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। मानव ऊतक का आणविक विश्लेषण नए दवा लक्ष्यों के चयन में सुधार कर सकता है और नैदानिक परीक्षणों औरदवा अनुमोदन की उच्च सफलता दर में योगदान कर सकता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत चिकित्सा की क्षमता प्रदान करता है, क्योंकि प्राप्त ऊतकप्रत्येक व्यक्ति के अद्वितीय जीनोमिक, एपिजेनोमिक, मेटाबोलिक, ग्लाइकोमिक और प्रोटिओमिक फिंगरप्रिंट को बरकरार रखता है।
सभी आणविक विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए उच्च और सुसंगत नमूना गुणवत्ता मौलिक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि नमूना पुनर्प्राप्ति के बाद तत्काल ठंड और बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र से बचना उच्च नमूना गुणों 9,20 के लिए महत्वपूर्ण है। -70 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों में दीर्घकालिक भंडारण ने प्रोटिओमिक प्रोफाइल9 की अखंडता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल पूर्वाग्रह को कम करने और वैज्ञानिक डेटा की तुलनात्मकता में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है, खासकर जब कई लोग (सर्जन, तकनीशियन और अन्य) या विभिन्न संस्थान नमूना प्रक्रिया में शामिल होते हैं। नमूना गुणवत्ता के अलावा, नमूनों का एनोटेशन एक और महत्वपूर्ण कारक है जिसे नैदानिक डेटा के साथ आणविक निष्कर्षों के सहसंबंध की अनुमति देने के लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है। हमारा प्रोटोकॉल इसे पूरा करने के लिए तीन आवश्यक सिद्धांतों पर निर्भर करता है: 1) एक नेत्र सर्जन द्वारा जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के लिए एक मानकीकृत नमूना प्रक्रिया, 2) प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा ओआर में नमूनों का तत्काल प्रसंस्करण और स्नैप-फ्रीजिंग, और 3) एक वेब-आधारित डेटाबेस में प्रत्येक नमूने का एक मेटाडेटा एनोटेशन जो शोधकर्ताओं को बाद के प्रयोगों के लिए नमूने जल्दी से खोजने की अनुमति देता है।
विट्रस नमूने20 के अलावा, यह वर्कफ़्लो आणविक विश्लेषण के लिए जलीय हास्य तरल बायोप्सी के मानकीकृत संग्रह को भी स्थापित करता है। जलीय हास्य आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक अत्यधिक सुलभ, जटिल तरल पदार्थ है जो न केवल पूर्वकाल के ओकुलर रोगों को दर्शाता है, बल्कि आंख के पीछे के खंड को भी दर्शाता है, जिसमें रेटिना रोग18,21 भी शामिल है। इस तथ्य के साथ कि जलीय हास्य के नमूनों की एक उच्च संख्या एकत्र की जा सकती है, उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी के दौरान, दुनिया भर में सबसे अधिक बार की जाने वाली सर्जरी में से एक, ये विशेषताएं इसे मानव आंखों से तरल बायोप्सी के लिए एक दिलचस्प स्रोत बनाती हैं। इस वर्कफ़्लो में स्थापित प्रत्येक नमूने का मानकीकृत मेटाडेटा एनोटेशन संभावित नैदानिक अनुवर्ती डेटा के साथ प्रोटिओम डेटा के सहसंबंध की भी अनुमति दे सकता है। यह नए रोगसूचक बायोमाकर्स की पहचान करने का रोमांचक अवसर प्रदान करता है जो भविष्य के रोगियों के लिए रोग का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है।
हालांकि, मानव शल्य चिकित्सा नमूनों के आणविक विश्लेषण में भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, जटिल प्रयोगात्मक जोड़तोड़ अक्सर केवल पशु और कोशिका मॉडल में संभव होते हैं। एक समाधान मानव रोग के साथ पशु या कोशिका मॉडल के आणविक प्रोफ़ाइल की तुलना करना हो सकता है। यह रणनीति अतिव्यापी प्रोटीन बायोमाकर्स और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकती है जिन्हें जानवरों या सेल मॉडल में मान्य किया जा सकता है ताकि सबसे आशाजनक उम्मीदवारों की पहचान की जा सके जो मानव रोग से संबंधित हैं औरनैदानिक परीक्षणों में सफल होने की संभावना है।
अंत में, हमारा वर्कफ़्लो ओआर और अनुसंधान प्रयोगशाला के बीच एक व्यावहारिक इंटरफ़ेस स्थापित करता है जो आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मानकीकृत और उच्च-थ्रूपुट संग्रह, एनोटेशन और उच्च गुणवत्ता वाले सर्जिकल नमूनों के भंडारण की अनुमति देता है, जो भविष्य के ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान आधार प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
वीबीएम एनआईएच अनुदान (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 और P30EY026877), स्टैनफोर्ड सेंटर फॉर ऑप्टिक डिस्क ड्रूसन, और रिसर्च टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस, न्यूयॉर्क, यूएसए द्वारा समर्थित है। जेडब्ल्यू और डीआर विट्रोरेटिनल सर्जरी फाउंडेशन, यूएसए द्वारा समर्थित हैं। डीआर को डेयर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है, जिसे लुंडबेक फाउंडेशन द्वारा प्रायोजित किया जाता है।
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |