Detta protokoll presenterar en integrerad biorepository-plattform för standardiserad insamling, annotering och biobankning av högkvalitativ mänsklig vattenhaltig humor och glaskroppsvätskebiopsier för molekylära nedströmsanalyser, inklusive proteomik, metabolomik och glykomik.
En kritisk utmaning inom translationell forskning är att etablera ett livskraftigt och effektivt gränssnitt mellan patientvård i operationssalen (OR) och forskningslaboratoriet. Här utvecklade vi ett protokoll för att förvärva högkvalitativa flytande biopsier för molekylära analyser från kammarvatten och glaskropp från patienter som genomgår ögonkirurgi. I detta arbetsflöde används en MORLI-vagn (Mobile Operating Room Lab Interface) utrustad med en dator, en streckkodsläsare och laboratorieinstrument, inklusive kylförvaring ombord, för att erhålla och arkivera humanbiologiska prover. En webbaserad databas som uppfyller datasekretess gör det möjligt att kommentera varje prov under dess livstid, och ett kartesiskt koordinatsystem gör det möjligt att spåra varje streckkodat prov i lagring, vilket möjliggör snabb och exakt hämtning av prover för nedströmsanalyser. Molekylär karakterisering av humana vävnadsprover fungerar inte bara som ett diagnostiskt verktyg (t.ex. för att skilja mellan infektiös endoftalmit och annan icke-infektiös intraokulär inflammation) utan representerar också en viktig komponent i translationell forskning, vilket möjliggör identifiering av nya läkemedelsmål, utveckling av nya diagnostiska verktyg och personlig terapi.
Molekylär profilering av flytande biopsier från det mänskliga ögat kan fånga lokalt anrikade vätskor som innehåller molekyler som DNA, RNA, proteiner, glykaner och metaboliter från högspecialiserade okulära vävnader. Flytande biopsier från glaskroppen i den bakre kammaren i det mänskliga ögat visade sig vara ett generellt säkert förfarande1. De möjliggör molekylär karakterisering av ögonsjukdomar hos levande människor och erbjuder potential att identifiera nya diagnostiska och terapeutiska strategier 2,3,4. Vattenkammarvattnet i ögats främre kammare har ännu högre kirurgisk tillgänglighet och kan erhållas i stort antal, t.ex. under kataraktkirurgi, som är en av de mest utförda operationerna. Inget standardiserat protokoll för insamling, annotering och biobankning av humant vattenhaltigt humör och glaskroppsbiopsier för molekylära nedströmsanalyser, inklusive proteomik, metabolomik och glykomik, finns dock tillgängligt förrän nu.
Här utvecklade vi ett protokoll för insamling och biobankning av högkvalitativa flytande biopsier för molekylära analyser från patienter som genomgår ögonkirurgi. Ett mobilt operationssalslabbgränssnitt (MORLI) gör det möjligt för en forskare att omedelbart snäppfrysa de insamlade proverna i streckkodade kryovialer på torris vid -80 °C i operationssalen (OR). Denna procedur säkerställer en hög och konsekvent provkvalitet för molekylär analys nedströms. Förutom utmärkt provkvalitet är noggrann annotering av prover i en biobank avgörande. Med hjälp av en webbaserad HIPAA-kompatibel REDCap-databas(Research Electronic Data Capture) 5 tillåter vårt arbetsflöde lagring av detaljerade metadata för varje prov, inklusive ålder, kön, sjukdom, sjukdomsstadium, provtyp och unika egenskaper hos operationen. Detta kommer att möjliggöra exakt framtida sökkapacitet, t.ex. för prover från en specifik sjukdom eller en viss grupp av patienter. Dessutom arkiveras den exakta platsen för varje prov i frysen med hjälp av ett kartesiskt rutnätsystem, vilket möjliggör effektiv provhämtning för nedströmsexperiment. Vi visar exempel på DNA-, protein-, glykan- och metabolitanalyser.
Vårt arbetsflöde utgör en praktisk och effektiv koppling mellan operationssalen och forskningslaboratoriet och utgör en värdefull grund för translationell forskning.
Kirurgiska prover från patienter möjliggör direkt molekylär karakterisering av sjukdom hos levande människor 2,3,4,14, och kan hjälpa till att övervinna begränsningarna hos cell- och djursjukdomsmodeller som inte helt rekapitulerar mänsklig sjukdom 15,16. Molekylär analys av mänsklig vävnad kan förbättra valet av nya läkemedelsmål och kan bidra till en högre framgångsgrad för kliniska prövningar och läkemedelsgodkännande17. Dessutom erbjuder detta tillvägagångssätt potentialen för personlig medicin, eftersom den erhållna vävnaden behåller det unika genomiska, epigenomiska, metabolomiska, glykomiska och proteomiska fingeravtrycket hos varje individ 2,18,19.
Hög och konsekvent provkvalitet är grundläggande för alla molekylära analysapplikationer. Tidigare studier har visat att omedelbar frysning efter provhämtning och undvikande av upprepade frys-/töcykler är avgörande för höga provkvaliteter 9,20. Långvarig lagring under flera år vid -70 °C påverkade inte signifikant integriteten hos den proteomiska profilen9. Ett standardiserat protokoll är en viktig grund för att minska partiskhet och förbättra jämförbarheten av vetenskapliga data, särskilt när flera personer (kirurger, tekniker och andra) eller olika institutioner är involverade i provtagningsprocessen. Förutom provkvaliteten är annoteringen av prover en annan viktig faktor som kräver standardisering för att möjliggöra korrelation av molekylära fynd med kliniska data. Vårt protokoll bygger på tre viktiga principer för att uppnå detta: 1) ett standardiserat provtagningsförfarande för vattenhaltiga humor- och glaskroppsvätskebiopsier av en ögonkirurg, 2) omedelbar bearbetning och snäppfrysning av prover i operationssalen av laboratoriepersonal och 3) en metadataanteckning av varje prov i en webbaserad databas som gör det möjligt för forskare att snabbt hitta prover för senare experiment.
Förutom glaskroppsprover20 etablerar detta arbetsflöde också den standardiserade samlingen av flytande biopsier med vattenhaltig humor för molekylär analys. Vattenkammarvattnet är en mycket tillgänglig, komplex vätska i ögats främre kammare som inte bara återspeglar okulära sjukdomar i det främre utan också i det bakre segmentet av ögat, inklusive retinal sjukdom18,21. Tillsammans med det faktum att ett stort antal vattenhaltiga humorprover kan samlas in, t.ex. under kataraktkirurgi, en av de mest utförda operationerna över hela världen, gör dessa funktioner det till en intressant källa för flytande biopsier från det mänskliga ögat. Den standardiserade metadataanteckningen för varje prov som fastställs i detta arbetsflöde kan också möjliggöra korrelation av proteomdata med prospektiva kliniska uppföljningsdata. Detta ger en spännande möjlighet att identifiera nya prognostiska biomarkörer som kan hjälpa till att uppskatta prognosen för framtida patienter.
Men molekylär analys av humana kirurgiska prover har också viktiga begränsningar. Till exempel är komplexa experimentella manipulationer ofta endast möjliga i djur- och cellmodeller. En lösning kan vara att jämföra den molekylära profilen hos djur- eller cellmodeller med den hos mänskliga sjukdomar. Denna strategi kan identifiera överlappande proteinbiomarkörer och terapeutiska mål som kan valideras i djur eller cellmodeller för att identifiera de mest lovande kandidaterna som korrelerar med mänsklig sjukdom och sannolikt kommer att lyckas i kliniska prövningar 4,16.
Sammanfattningsvis etablerar vårt arbetsflöde ett praktiskt gränssnitt mellan OR och forskningslaboratoriet som möjliggör standardiserad och hög genomströmningsinsamling, annotering och lagring av högkvalitativa kirurgiska prover för molekylär nedströmsanalys, vilket ger en värdefull grund för framtida translationell forskning.
The authors have nothing to disclose.
VBM stöds av NIH-bidrag (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 och P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen och Research to Prevent Blindness, New York, USA. JW och DR stöds av VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR stöds av DARE Fellowship, som sponsras av Lundbeck Foundation.
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |