Immunfluorescerende avbildning er begrenset av evnen til å observere komplekse, tidsavhengige biologiske prosesser i bare et enkelt øyeblikksbilde i tid. Denne studien skisserer en live-imaging tilnærming utført på presisjonskutt mus submandibulære kjertelskiver. Denne tilnærmingen muliggjør sanntidsobservasjon av celle-celle-interaksjoner under homeostase og prosessene for regenerering og reparasjon.
Spyttkjertel regenerering er en kompleks prosess som involverer intrikate interaksjoner mellom ulike celletyper. Nylige studier har kastet lys over makrofagenes sentrale rolle i å drive den regenerative responsen. Vår forståelse av denne kritiske rollen har imidlertid først og fremst basert seg på statiske synspunkter hentet fra faste vevsbiopsier. For å overvinne denne begrensningen og få innsikt i disse interaksjonene i sanntid, skisserer denne studien en omfattende protokoll for dyrking av spyttkjertelvev ex vivo og fange levende bilder av cellemigrasjon.
Protokollen innebærer flere viktige trinn: Først blir musens submandibulære spyttkjertelvev forsiktig skåret ved hjelp av en vibratome og deretter dyrket ved en luft-væske-grensesnitt. Disse skivene kan bli skadet med vilje, for eksempel gjennom eksponering for stråling, for å indusere cellulær skade og utløse den regenerative responsen. For å spore spesifikke celler av interesse, kan de bli endogent merket, for eksempel ved å benytte spyttkjertelvev samlet fra genetisk modifiserte mus hvor et bestemt protein er merket med grønt fluorescerende protein (GFP). Alternativt kan fluorescerende konjugerte antistoffer brukes til å flekke celler som uttrykker spesifikke celleoverflatemarkører av interesse. Når de er forberedt, blir spyttkjertelskivene utsatt for levende avbildning ved hjelp av et konfokalbildesystem med høyt innhold over en varighet på 12 timer, med bilder tatt med 15 minutters intervaller. De resulterende bildene blir deretter samlet for å lage en film, som deretter kan analyseres for å trekke ut verdifulle celleadferdsparametere. Denne innovative metoden gir forskere et kraftig verktøy for å undersøke og bedre forstå makrofaginteraksjoner i spyttkjertelen etter skade, og dermed fremme vår kunnskap om de regenerative prosessene som spilles i denne dynamiske biologiske konteksten.
Makrofager har vist seg å spille stadig viktigere roller i prosessene for regenerering og reparasjon, som strekker seg utover deres klassiske immunfunksjon 1,2. Faktisk er makrofager involvert i en mengde prosesser relatert til regenerering, som viser kritisk regulatorisk aktivitet i alle stadier av reparasjon, samt arrdannelse og fibrose 3,4. Vevsbosatte makrofager er svært heterogene celletyper med komplekse mekanismer som driver forskjellige cellulære fenotyper, og de spiller viktige roller i organutvikling, funksjon og homeostase (som gjennomgått i5). Vevsbosatte makrofager oppstår opprinnelig fra forløpere i eggeplommesekken og fosterleveren, og de erstattes deretter av spredning eller av benmargsavledede blodmonocytter i varierende hastighet, avhengig av levetiden til eksisterende makrofager og vevet eller nisjen derde bor 6,7.
Det er viktig at vevsbosatte makrofager spres gjennom alle vev og bidrar til ulike organfunksjoner. De er unikt programmert av deres mikromiljø for å utføre nisjespesifikke funksjoner. Av denne grunn gir lokaliseringen av makrofager i vevet innsikt i deres funksjon, med unike populasjoner observert i lunge, brystkjertel, tarm, hud og muskel 8,9,10. Under brystkjertelutvikling er duktale makrofager nært forbundet med duktaltreet, og deres uttømming resulterer i betydelig redusert forgrening11. Videre kreves makrofager for morfogenese under puberteten og alveologenese i svangerskapet, hvor de aktivt overvåker epitelet. Ved muskelskade “bor” en spesifikk populasjon av makrofager på skadestedet, og gir en forbigående nisje der de leverer proliferasjonsinduserte signaler som kreves for stamcelleproliferasjon. Dermed viser de den spesialiserte rollen som distinkte makrofagpopulasjoner i styringen av reparasjonsprosessen2. I lungen oppstår et lignende fenomen der interstitielle makrofager primer interleukin (IL)-R1-uttrykkende alveolære type II (AT2) celler for konvertering til skadeassosierte forbigående progenitorer gjennom frigjøring avIL-1B 12. Videre har nyere forskning vist at makrofager er essensielle for regenerering av musens submandibulære spyttkjertel (SMG) etter bestrålingsskade, og i deres fravær forstyrres epitelregenerering13. Samlet sett fremhever disse dataene betydningen av makrofagaktivering og funksjon i forbigående inflammatoriske nisjer etter vevsskade, samt under homeostase.
Makrofager er aktive celler, og deres funksjoner involverer interaksjoner med en rekke forskjellige celletyper, inkludert direkte celle-cellekontakt14,15, samt mer indirekte metoder som sekresjon av løselige faktorer 2,16, som er essensielle for nisjeregulering. Mens klassisk immunfluorescerende avbildning er nyttig for å begynne å avdekke disse interaksjonene, er den begrenset ved å skildre bare et enkelt øyeblikksbilde i tid, og dermed utelate mange tidspunkter som er kritiske for en svært dynamisk regenerativ prosess17,18. Som betydningen av timing og fremveksten av forskjellige bølger av regenerering kommer i skarpere fokus, er det viktig å dissekere disse prosessene i større detalj.
Strålebehandling er en livreddende behandling for mange mennesker diagnostisert med kreft. Mens ofte effektiv på å krympe eller eliminere svulsten (e), kan strålebehandling også skade sunt vev som ligger i strålingsfeltet og fremkalle en immunrespons. Stråleskade kan indusere rask makrofagrekruttering, og direkte og indirekte immunmodulerende responser19,20. Spyttkjertlene blir ofte utilsiktet bestrålt under behandling for hode- og nakkekreft21,22, noe som fører til epitelskade, celleatrofi og fibrose23,24, noe som resulterer i xerostomi eller kronisk munntørrhet25.
Spyttkjertelen består av en mengde celletyper og strukturer, inkludert men ikke begrenset til epitelceller (både spyttproduserende acinarceller og spytttransporterende duktale celler), myoepitelceller, epiteliale stamceller, nerver, blodkar, immunceller, fibroblaster og ekstracellulær matrise (ECM). Rollen og responsen til mange av disse celletypene i den regenerative responsen er tidligere beskrevet 26,27,28,29,30. Men hvordan disse forskjellige cellene samhandler under homeostase og regenerering, og spesielt hvordan immunceller som makrofager oppfører seg, er mindre godt studert. Dette manuskriptet beskriver en nyetablert metode for å studere levende interaksjoner mellom SMG-makrofager og andre celler av interesse i ex vivo-vev. SMG er skåret på en vibratom, farget for overflatemarkører og avbildet i opptil 12 timer. Ved hjelp av denne metoden kan fagocytose av omgivende celler ved makrofager observeres, makrofagmigrasjonskinetikk kan studeres, og direkte celle-celle-interaksjoner mellom makrofager og epitelceller kan demonstreres.
Evnen til å dyrke spyttkjertelvev ex vivo gir en utmerket mulighet til å studere celle-celle-interaksjoner i sammenheng med både homeostase og skaderespons. Selv om intravital avbildning av musens submandibulære kjertel er mulig39,40, avhenger denne teknikken av å bruke fluorescerende reportermusemodeller for endogent å merke celler av interesse og må utføres under terminal anestesi. Her beskrives en metode for å dyrke submandibulære kjertelskiver ex vivo, som opprettholder cellulær arkitektur og celle-celle-interaksjoner. Denne tilnærmingen foredler dagens levende bildebehandlingsteknikker og gir et alternativ til intravital bildebehandling.
Det langsiktige vedlikeholdet av vev ved hjelp av denne teknikken er avhengig av dyrking av skiver ved en luft-væske-grensesnitt. Tidligere eksplant-modeller 26,41 har sannsynligvis oppnådd vellykket kultur i bare noen få dager fordi de var nedsenket i media og i hovedsak “kvalt”. I motsetning til dette opprettholder bruken av et luft-væskegrensesnittkultursystem vevshelse og struktur i en lengre periode, noe som sikrer bildebehandling av høy kvalitet. Metoden med å montere SMG-skiver før avbildning, med en liten mengde media og i et plassbegrenset kammer for å holde skiven flat, er integrert i teknikkens suksess. Visualisering av celler i denne analysen avhenger av endogent merkede reportermus eller fluorescerende konjugerte antistoffer. Overfloden av transgene fluorescerende reportermusemodeller og konjugerte antistoffer rettet mot spesifikke celletyper og undergrupper gjør denne metoden egnet for å utforske forskjellige cellespesifikke interaksjoner.
Selv om denne metoden gir en god modell av vev in situ og ex vivo bestrålingsskader resulterer i acinar og duktal strukturatrofi, lik det som forekommer in vivo13, kan noen elementer ikke rekapituleres ex vivo. Disse inkluderer mangel på fungerende vaskulatur og nevroninngang, samt fravær av infiltrerende inflammatoriske celler. Gitt den veldokumenterte rollen som blodkar og nerver i spyttkjertelhomeostase og regenerering26,42 og betydningen av migrerende immunceller43, som T- og B-celler, i spyttkjertelfunksjon, skaderespons, infeksjon og Sjögrens syndrom (SS) patogenese (som gjennomgått i44), kan denne analysen gå glipp av noen viktige cellulære interaksjoner. I tillegg kan svært raske migrerende hendelser, som Natural Killer (NK) celle45 og Dendritic Cell (DC) 46 bevegelse, bli savnet ved avbildning hvert 15. minutt. Imidlertid kan bildeintervaller optimaliseres for å studere de spesifikke celle-celle-interaksjonene av interesse, og evnen til å avbilde i 3 dimensjoner gjennom z-stakker tillater vurdering av 3D-cellebevegelse. Sikker montering av vevet under avbildning er avgjørende for kvantifisering, for eksempel cellesporingsmålinger. Videre, selv om denne studien benyttet musevev, gir protokollen en levedyktig metode for å studere celle-celle-interaksjoner i menneskelige spyttkjertler, og genererer verdifull translasjonsinformasjon som er uoppnåelig gjennom andre metoder.
Mens rollen til vevsbosatte makrofager i homeostase og regenerering har blitt demonstrert i flere vev 2,10,11,12, forblir deres rolle i spyttkjertlene stort sett ubesvart. Selv om det er kjent at makrofager er essensielle for epitelial regenerering etter bestrålingsskade13, er de nøyaktige mekanismene bak denne effekten fortsatt ukjente. Live imaging av spyttkjertelskiver muliggjør sanntidsvisualisering og analyse av kompleks vevsdynamikk, som ofte savnes av tradisjonell konfokal avbildning. I tillegg er det tydelig at makrofager gjennomgår dynamiske endringer i form mens de utfører forskjellige funksjoner in vivo 47,48,49, og denne protokollen gir sannsynligvis en bedre representasjon av disse endringene enn et typisk statisk syn i fast vev. Fremtidige studier kan bruke denne teknikken til å undersøke hvordan cellekommunikasjon endres i løpet av homeostase, skade og regenerering / oppløsning. Denne tilnærmingen vil være nyttig for å belyse viktige signalveier og hendelser som til slutt kan gi terapeutiske fordeler.
The authors have nothing to disclose.
SE er finansiert av Wellcome Trust grant 108906/Z/15/Z; EE er finansiert av UKRI / MRC grant MR / S005544 / 1 og av et kanslerstipend fra University of Edinburgh. Figur 1A er laget med BioRender.com.
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
24 well plate | Corning | 3524 | |
35 mm dish | Falcon | 353001 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
Imaging and analysis software | Harmony | ||
Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |