Immunofluorescensavbildning begränsas av förmågan att observera komplexa, tidsberoende biologiska processer i en enda ögonblicksbild. Denna studie beskriver en live-bildmetod som utförs på precisionsskurna mussubmandibulära körtelskivor. Detta tillvägagångssätt möjliggör realtidsobservation av cell-cellinteraktioner under homeostas och processerna för regenerering och reparation.
Regenerering av spottkörtlar är en komplex process som involverar intrikata interaktioner mellan olika celltyper. Nya studier har belyst den centrala roll som makrofager spelar för att driva det regenerativa svaret. Vår förståelse av denna kritiska roll har dock främst förlitat sig på statiska bilder erhållna från fixerade vävnadsbiopsier. För att övervinna denna begränsning och få insikter i dessa interaktioner i realtid, beskriver denna studie ett omfattande protokoll för odling av spottkörtelvävnad ex vivo och fånga levande bilder av cellmigration.
Protokollet omfattar flera viktiga steg: Först skärs musens submandibulära spottkörtelvävnad försiktigt med hjälp av en vibratom och odlas sedan vid ett luft-vätskegränssnitt. Dessa skivor kan skadas avsiktligt, till exempel genom exponering för strålning, för att inducera cellskador och utlösa den regenerativa responsen. För att spåra specifika celler av intresse kan de märkas endogent, till exempel genom att använda spottkörtelvävnad som samlats in från genetiskt modifierade möss där ett visst protein är märkt med grönt fluorescerande protein (GFP). Alternativt kan fluorescerande konjugerade antikroppar användas för att färga celler som uttrycker specifika cellytemarkörer av intresse. När de väl har förberetts utsätts spottkörtelskivorna för live-avbildning med hjälp av ett konfokalt bildsystem med högt innehåll under en varaktighet av 12 timmar, med bilder tagna med 15 minuters intervall. De resulterande bilderna sammanställs sedan för att skapa en film, som sedan kan analyseras för att extrahera värdefulla cellbeteendeparametrar. Denna innovativa metod ger forskare ett kraftfullt verktyg för att undersöka och bättre förstå makrofaginteraktioner i spottkörteln efter skada, och därigenom öka vår kunskap om de regenerativa processer som spelar in i detta dynamiska biologiska sammanhang.
Makrofager har visat sig spela en allt viktigare roll i regenererings- och reparationsprocesserna, som sträcker sig bortom deras klassiska immunfunktion 1,2. Faktum är att makrofager är involverade i en uppsjö av processer relaterade till regenerering, som uppvisar kritisk reglerande aktivitet i alla stadier av reparation, såväl som ärrbildning och fibros 3,4. Vävnadsresidenta makrofager är mycket heterogena celltyper med komplexa mekanismer som driver olika cellulära fenotyper, och de spelar viktiga roller i organutveckling, funktion och homeostas (som granskats i5). Vävnadsresidenta makrofager uppstår initialt från prekursorer i gulesäcken och fostrets lever, och de ersätts därefter av proliferation eller av blodmonocyter från benmärg i varierande takt, beroende på livslängden hos befintliga makrofager och den vävnad eller nisch i vilkende finns 6,7.
Det är viktigt att notera att makrofager som är bosatta i vävnader är spridda i alla vävnader och bidrar till olika organfunktioner. De är unikt programmerade av sin mikromiljö för att utföra nischspecifika funktioner. Av denna anledning ger lokaliseringen av makrofager i vävnaden insikt i deras funktion, med unika populationer observerade i lungan, bröstkörteln, tarmen, huden och muskeln 8,9,10. Under utvecklingen av bröstkörtlarna är duktala makrofager intimt förknippade med det duktala trädet, och deras utarmning resulterar i signifikant minskad förgrening11. Dessutom krävs makrofager för morfogenes under puberteten och alveologenes under graviditeten, där de aktivt övervakar epitelet. Vid muskelskada “bor” en specifik population av makrofager inom skadestället, vilket ger en övergående nisch där de tillhandahåller proliferationsinducerade signaler som krävs för stamcellsproliferation. Således uppvisar de den specialiserade roll som distinkta makrofagpopulationer spelar för att styra reparationsprocessen2. I lungan uppstår ett liknande fenomen där interstitiella makrofager primar interleukin (IL)-R1-uttryckande alveolära typ II (AT2)-celler för omvandling till skadeassocierade transienta stamceller genom frisättning avIL-1B 12. Dessutom har ny forskning visat att makrofager är viktiga för regenerering av musens submandibulära spottkörtel (SMG) efter strålningsskada, och i deras frånvaro störs epitelregenereringen13. Sammantaget belyser dessa data vikten av makrofagaktivering och funktion i övergående inflammatoriska nischer efter vävnadsskada, såväl som under homeostas.
Makrofager är aktiva celler, och deras funktioner involverar interaktioner med en mängd olika celltyper, inklusive direkt cell-cellkontakt14,15, samt mer indirekta metoder som utsöndring av lösliga faktorer 2,16, som är väsentliga för nischreglering. Även om klassisk immunofluorescensavbildning är användbar för att börja reda ut dessa interaktioner, är den begränsad genom att endast avbilda en enda ögonblicksbild i tiden, vilket utelämnar många tidpunkter som är kritiska för en mycket dynamisk regenerativ process 17,18. Eftersom betydelsen av timing och uppkomsten av olika föryngringsvågor blir allt tydligare, är det viktigt att dissekera dessa processer mer i detalj.
Strålbehandling är en livräddande behandling för många som diagnostiserats med cancer. Även om strålbehandling ofta är effektiv för att krympa eller eliminera tumören/tumörerna, kan den också skada friska vävnader som ligger i strålfältet och framkalla ett immunsvar. Strålskador kan inducera snabb rekrytering av makrofager och direkta och indirekta immunmodulerande svar19,20. Spottkörtlarna bestrålas ofta oavsiktligt under behandling av huvud- och halscancer21,22, vilket leder till epitelskador, cellatrofi och fibros23,24, vilket resulterar i xerostomi eller kronisk muntorrhet25.
Spottkörteln består av en uppsjö av celltyper och strukturer, inklusive men inte begränsat till epitelceller (både salivproducerande acinarceller och salivtransporterande duktala celler), myoepitelceller, epitelceller, nerver, blodkärl, immunceller, fibroblaster och extracellulär matris (ECM). Rollen och responsen för många av dessa celltyper i den regenerativa responsen har tidigare beskrivits 26,27,28,29,30. Hur dessa olika celler interagerar under homeostas och regenerering, och särskilt hur immunceller som makrofager beter sig, är dock mindre väl studerat. Detta manuskript beskriver en nyetablerad metod för att studera de levande interaktionerna mellan SMG-makrofager och andra celler av intresse i ex vivo-vävnad. Kulsprutan skivas på en vibratom, färgas för ytmarkörer och avbildas i upp till 12 timmar. Med hjälp av denna metod kan fagocytos av omgivande celler med makrofager observeras, makrofagmigrationskinetik kan studeras och direkta cell-cellinteraktioner mellan makrofager och epitelceller kan påvisas.
Möjligheten att odla spottkörtelvävnad ex vivo ger en utmärkt möjlighet att studera cell-cellinteraktioner i samband med både homeostas och skaderespons. Även om intravital avbildning av musens submandibulära körtel är möjlig39,40, är denna teknik beroende av att man använder fluorescerande reportermusmodeller för att endogent märka celler av intresse och måste utföras under terminal anestesi. Här beskrivs en metod för att odla submandibulära körtelskivor ex vivo, med bibehållen cellulär arkitektur och cell-cellinteraktioner. Detta tillvägagångssätt förfinar nuvarande tekniker för live-avbildning och ger ett alternativ till intravital avbildning.
Det långsiktiga underhållet av vävnad med hjälp av denna teknik bygger på odling av skivor vid ett luft-vätskegränssnitt. Tidigare explanteringsmodeller 26,41 har sannolikt uppnått framgångsrik odling under bara några dagar eftersom de var nedsänkta i media och i princip “kvävda”. Däremot bibehåller användningen av ett luft-vätskegränssnittsodlingssystem vävnadshälsa och struktur under en längre period, vilket säkerställer högkvalitativ avbildning. Metoden att montera SMG-skivor före avbildning, med en liten mängd media och i en utrymmesbegränsad kammare för att hålla skivan platt, är avgörande för teknikens framgång. Visualisering av celler i denna analys beror på endogent märkta reportermöss eller fluorescerande konjugerade antikroppar. Överflödet av transgena fluorescerande reportermusmodeller och konjugerade antikroppar riktade mot specifika celltyper och undergrupper gör denna metod lämplig för att utforska olika cellspecifika interaktioner.
Även om denna metod ger en bra modell av vävnad in situ och ex vivo bestrålningsskada resulterar i acinär- och duktal strukturatrofi, liknande vad som sker in vivo13, kan vissa element inte rekapituleras ex vivo. Dessa inkluderar bristen på fungerande kärl och neuronal input, såväl som frånvaron av infiltrerande inflammatoriska celler. Med tanke på den väldokumenterade roll som blodkärl och nerver spelar i spottkörtelhomeostas och regenerering 26,42 och betydelsen av migrerande immunceller43, såsom T- och B-celler, i spottkörtelfunktion, skaderespons, infektion och Sjögrens syndrom (SS) patogenes (som granskats i44), kan denna analys missa några viktiga cellulära interaktioner. Dessutom kan mycket snabba migrationshändelser, såsom förflyttning av naturliga mördarceller (NK)45 och dendritiska celler (DC)46, missas genom avbildning var 15:e minut. Avbildningsintervallen kan dock optimeras för att studera de specifika cell-cellinteraktioner som är av intresse, och förmågan att avbilda i 3 dimensioner genom z-staplar möjliggör bedömning av 3D-cellrörelser. Säker montering av vävnaden under avbildning är avgörande för kvantifiering, till exempel cellspårningsmätningar. Dessutom, även om denna studie använde musvävnad, ger protokollet en livskraftig metod för att studera cell-cellinteraktioner i mänskliga spottkörtlar, vilket genererar värdefull translationell information som inte kan uppnås med andra metoder.
Medan rollen av vävnadsresidenta makrofager i homeostas och regenerering har visats i flera vävnader 2,10,11,12, är deras roll i spottkörtlarna i stort sett obesvarad. Även om det är känt att makrofager är nödvändiga för epitelregenerering efter strålningsskada13, är de exakta mekanismerna bakom denna effekt fortfarande okända. Live-avbildning av spottkörtelskivor möjliggör visualisering och analys i realtid av komplex vävnadsdynamik, som ofta missas av traditionell konfokal avbildning. Dessutom är det uppenbart att makrofager genomgår dynamiska förändringar i form medan de utför olika funktioner in vivo 47,48,49, och detta protokoll ger sannolikt en bättre representation av dessa förändringar än en typisk statisk vy i fixerad vävnad. Framtida studier kan använda denna teknik för att undersöka hur cell-cell-kommunikationen förändras under homeostas, skada och regenerering/upplösning. Detta tillvägagångssätt kommer att vara användbart för att belysa viktiga signalvägar och händelser som i slutändan kan erbjuda terapeutiska fördelar.
The authors have nothing to disclose.
SE finansieras av Wellcome Trust grant 108906/Z/15/Z; EE finansieras av UKRI/MRC-anslaget MR/S005544/1 och av ett Chancellor’s Fellowship från University of Edinburgh. Figur 1A skapas med BioRender.com.
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
24 well plate | Corning | 3524 | |
35 mm dish | Falcon | 353001 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
Imaging and analysis software | Harmony | ||
Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |