JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

Udvikling af multiplex realtids RT-qPCR-assays til påvisning af SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi præsenterer to sondebaserede interne et-trins RT-qPCR-sæt til almindelige luftvejsvira. Det første assay er for SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 og H3N2) og influenza B. Den anden er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analyser kan implementeres med succes i ethvert specialiseret laboratorium.

Abstract

Det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der forårsager Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mod offentlighedens sundhed. I influenzasæsoner kan spredningen af SARS-CoV-2 og andre luftvejsvira forårsage en byrde af luftvejssygdomme i hele befolkningen, der er vanskelig at håndtere. Til det skal respiratoriske vira SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåges nøje i de kommende efterårs- og vintersæsoner, især i tilfælde af SARS-CoV-2, influenza A og influenza B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som modtagelige populationer, transmissionsmåde og kliniske syndromer. Uden målspecifikke analyser kan det være udfordrende at skelne mellem tilfælde af disse vira på grund af deres ligheder. Derfor vil et følsomt og målrettet multiplexassay, der let kan skelne mellem disse virale mål, være nyttigt for sundhedspersonale. I denne undersøgelse udviklede vi et realtids revers transkriptase-PCR-baseret assay ved hjælp af et internt udviklet R3T et-trins RT-qPCR-kit til samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier af deres syntetiske RNA’er kan vi med succes identificere SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og MERS-CoV-mål samtidigt med 100% specificitet. Denne analyse viser sig at være nøjagtig, pålidelig, enkel, følsom og specifik. Den udviklede metode kan bruges som et optimeret SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk assay på hospitaler, medicinske centre og diagnostiske laboratorier samt til forskningsformål.

Introduction

Pandemien af den igangværende coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er forårsaget af den nye coronavirus kendt som det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund af SAR-CoV-2’s stærke smitsomhed og kapacitet til hurtig transmission opstod COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte sig hurtigt over hele verden. Dette førte til sidst til starten af tegn på åndedrætsbesvær og endda død 2,3,4. COVID-19 er blevet erklæret en pandemi i mere end 213 lande og forventer en kraftig stigning i antallet af bekræftede tilfælde, som det fremgår af papirerne offentliggjort af forskellige forskningsundersøgelser 3,5. COVID-19 overføres primært af små åndedrætsdråber, som inficerede personer frigiver i miljøet og derefter udsættes for sårbare personer gennem indånding eller tæt kontakt med forurenede overflader. Når disse dråber kommer i kontakt med slimhinden i øjne, mund eller næse, kan en person blive smittet6. Statistikker frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) viser, at der har været mere end 76 millioner bekræftede tilfælde af pandemien på verdensplan med svimlende 7 millioner dødsfald7. FN klassificerede således pandemien forårsaget af COVID-19-sygdommen som en katastrofe på grund af dens direkte indvirkning på milliarder af menneskers liv over hele kloden og havde vidtrækkende økonomiske, miljømæssige og sociale virkninger.

Folkesundhedsinitiativer, herunder grundig testning, tidlig påvisning, kontaktsporing og isolering af tilfælde, har alle vist sig at være afgørende for at holde denne pandemi under kontrol 8,9,10,11. Vintermånederne vil øge cirkulationen af andre luftvejsvira som influenza A og B med COVID-19-lignende symptomer, hvilket gør det vanskeligt at identificere, spore og isolere COVID-19-tilfælde tidligt. Hvert år starter influenza A- og B-udbrud i det sene efterår eller begyndelsen af januar med en forudsigelig sæsonudsving12. Talrige epidemiologiske træk deles af SARS-CoV-2- og influenzavirus. Desuden deler ligheder i de modtagelige populationer, der inkluderer børn, ældre, immunkompromitterede og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, hjerte- og nyresvigt eller diabetes12,13. Disse vira deler ikke kun sårbare populationer, men også transmissionsveje for kontakt og åndedrætsdråber14. Det forventes, at patienter sandsynligvis kan indgå mere end en af disse respiratoriske vira, når influenzasæsonen nærmer sig14. Til det skal screeningen af SARS-CoV-2 og influenzavirus udføres på symptomatiske patienter, før de isoleres. Det er ikke muligt at køre separate tests for de tre vira (SARS-CoV-2, influenza A og influenza B) på grund af den globale mangel på ressourcer til nukleinsyreekstraktion og diagnostik. For at screene dem alle i en reaktion skal der udvikles en metode eller test.

Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS)-CoV er et familiemedlem til human coronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolater kom fra en indlagt patient i Saudi-Arabien, der var død i september 2012 på grund af akutte åndedrætsproblemer15. Der er beviser, der tyder på, at en fremtrædende reservoirvært for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist, at vira fra inficerede dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan inficere mennesker16,17. Mennesker inficeret med denne virus kan sprede den til andre gennem tæt kontakt18. Pr. 26. januar 2018 havde der været 2143 laboratoriebekræftede tilfælde af MERS-CoV-infektion, herunder 750 dødsfald globalt19. De mest typiske MERS-CoV symptomer er hoste, feber og åndenød. MERS-CoV-infektioner er også blevet rapporteret at udvise lungebetændelse, diarré og gastrointestinale sygdomssymptomer20. I øjeblikket er der ingen kommerciel vaccine eller specifik behandling for MERS-CoV tilgængelig. Derfor er hurtig og præcis diagnose afgørende for at forhindre de udbredte MERS-CoV-udbrud og differentiere MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sygdommen.

Til dato er der foreslået mange tilgange til at detektere disse vira, såsom multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserede biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-test i en gryde 32, DNA-aptamer33, loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP)19,34 osv. Hver af de ovennævnte metoder har unikke fordele og ulemper med hensyn til følsomhed og specificitet. Blandt disse metoder er den nukleinsyreamplifikationsbaserede test: multiplex qRT-PCR, den mest almindelige og anses for at være guldstandarden til diagnosticering af SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og MERS-CoV.

I denne undersøgelse designede og vurderede vi forskellige primerkombinationer og sonder til effektiv, nøjagtig og samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved hjælp af standard twist syntetiske virale RNA’er. De multipleksede assays udviklet til enten MERS-CoV eller SARS-CoV-2 målgener anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO). Disse gener koder generelt for proteiner og komplekser, der bidrager til dannelsen af et replikations-/transkriptionskompleks (RTC)35, såsom regionen inden for den åbne læseramme 1a (ORF1a), der anvendes til MERS-CoV-assay. Derudover kodes strukturelle proteiner af de gener, der anvendes i diagnostiske assays, såsom opstrømsregionen af kuvertgenet (upE) og nukleocapsidgenet (N), der anvendes til henholdsvis MERS-CoV- og SARS-Cov-2-assays, 35,36. Vi brugte internt R3T et-trins RT-qPCR-sæt til at etablere RT-qPCR til påvisning af vira37. Virusdetektion, følsomhed, specificitet og dynamisk område af vores R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primersæt blev testet og evalueret ved hjælp af 10 gange serielle fortyndinger af standard twist syntetiske RNA’er. Den laveste praktiske detektionsgrænse var ca. 10 udskriftskopier pr. Reaktion. Som et resultat kan det interne R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primer-/sondesæt med succes anvendes og implementeres til rutinemæssig samtidig diagnose af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Taq polymeraseekspression og oprensning Konstruer et plasmid med et spaltbart hexa-histidinmærke ved enzymets C-terminal. 50 ng af ekspressionsvektoren omdannes til E. coli BL21-(DE3)-stamme efter standardprotokol38. De transformerede celler podes i fire 6 L-kolber, der hver indeholder 2 liter 2YT-mediebouillon ved 37 °C, omrystes ved 170 omdr./min., indtil OD 600 på 0,8 eller cellenummer 6,4 x 108 er nået. Taq-pol…

Representative Results

I de senere år har der været betydelige fremskridt i den diagnostiske tilgang til påvisning af almindelige respiratoriske vira ved hjælp af PCR-tilgange 21,22,23,24,25. På trods af disse fremskridt er den multipleksede tilgang, som gør det muligt at detektere flere vira i en enkelt test, imidlertid ikke blevet implementeret bredt, især i RT-qPCR-platfor…

Discussion

Der er en tung økonomisk byrde for sundhedssystemet over hele verden som følge af de høje infektions- og dødelighedsrater på grund af spredningen af almindelige luftvejsvira såsom SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV-varianter 12,19,20. Motiveret af ansvarsfølelsen mod at lette denne byrde indså vi behovet for en hurtig, præcis og tilgængelig diagnostisk analyse såsom RT-qPCR for at skelne mellem disse almindelige …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af King Abdullah University of Science and Technology gennem kernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

SARS-CoV-2Influenza AInfluenza BMERS-CoVMultiplex Real-time RT-qPCRRespiratory VirusesIn-house Developed R3T One-step RT-qPCR KitDiagnostic AssaySimultaneous DetectionSensitivitySpecificity
check_url/fr/65822?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image