Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV
Summary
Wir präsentieren zwei sondenbasierte, einstufige RT-qPCR-Kits für gängige Atemwegsviren. Der erste Test ist für SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 und H3N2) und Influenza B. Die zweite ist für SARS-Cov-2 (N) und MERS (UpE und ORF1a). Diese Assays können in jedem spezialisierten Labor erfolgreich implementiert werden.
Abstract
Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit der Bevölkerung dar. Während der Grippesaison kann die Ausbreitung von SARS-CoV-2 und anderen Atemwegsviren zu einer bevölkerungsweiten Belastung durch Atemwegserkrankungen führen, die schwer zu bewältigen ist. Dazu müssen die Atemwegsviren SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und das Middle East Respiratory Syndrome (MERS-CoV) in der kommenden Herbst- und Wintersaison sorgfältig überwacht werden, insbesondere im Fall von SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B, die ähnliche epidemiologische Faktoren wie anfällige Bevölkerungsgruppen, Übertragungswege und klinische Syndrome aufweisen. Ohne zielspezifische Assays kann es aufgrund ihrer Ähnlichkeiten schwierig sein, zwischen Fällen dieser Viren zu unterscheiden. Dementsprechend wird ein sensitiver und zielgerichteter Multiplex-Assay, der diese viralen Ziele leicht unterscheiden kann, für Ärzte nützlich sein. In dieser Studie haben wir einen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR-basierten Assay entwickelt, der ein intern entwickeltes einstufiges R3T-RT-qPCR-Kit für den gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, verwendet. Mit nur 10 Kopien ihrer synthetischen RNAs können wir SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und MERS-CoV-Ziele gleichzeitig mit 100%iger Spezifität identifizieren. Dieser Assay erweist sich als genau, zuverlässig, einfach, empfindlich und spezifisch. Die entwickelte Methode kann als optimierter SARS-CoV-2-, Influenza-A-, Influenza-B- und SARS-CoV-2-, MERS-CoV-Diagnosetest in Krankenhäusern, medizinischen Zentren und diagnostischen Laboren sowie zu Forschungszwecken eingesetzt werden.
Introduction
Die Pandemie der anhaltenden Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das neuartige Coronavirus verursacht, das als schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1 bekannt ist. Aufgrund der starken Ansteckungsfähigkeit und der Fähigkeit von SAR-CoV-2 zur schnellen Übertragung entstand die COVID-19-Pandemie in der Stadt Wuhan, China, und breitete sich schnell auf der ganzen Welt aus. Dies führte schließlich zum Auftreten von Atemnotsymptomen und sogar zum Tod 2,3,4. COVID-19 wurde in mehr als 213 Ländern zur Pandemie erklärt, wobei ein steiler Anstieg der Zahl der bestätigten Fälle erwartet wird, wie aus den in verschiedenen Forschungsstudien veröffentlichten Studien hervorgeht 3,5. COVID-19 wird hauptsächlich durch kleine Tröpfchen übertragen, die infizierte Personen in die Umwelt abgeben und dann durch Einatmen oder engen Kontakt mit kontaminierten Oberflächen gefährdeten Personen ausgesetzt werden. Wenn diese Tröpfchen mit der Schleimhaut von Augen, Mund oder Nase in Kontakt kommen, kann sich eine Person infizieren6. Statistiken der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zeigen, dass es weltweit mehr als 76 Millionen bestätigte Fälle der Pandemie gibt, mit erschütternden 7 Millionen Todesfällen7. So stuften die Vereinten Nationen die durch die COVID-19-Krankheit verursachte Pandemie als Katastrophe ein, da sie sich direkt auf das Leben von Milliarden von Menschen auf der ganzen Welt auswirkt und weitreichende wirtschaftliche, ökologische und soziale Auswirkungen hat.
Initiativen im Bereich der öffentlichen Gesundheit, einschließlich gründlicher Tests, Früherkennung, Kontaktverfolgung und Fallisolierung, haben sich als entscheidend erwiesen, um diese Pandemie unter Kontrolle zu halten 8,9,10,11. In den Wintermonaten wird die Zirkulation anderer Atemwegsviren wie Influenza A und B mit COVID-19-ähnlichen Symptomen zunehmen, was es schwierig macht, COVID-19-Fälle frühzeitig zu identifizieren, aufzuspüren und zu isolieren. Jedes Jahr beginnt der Ausbruch der Influenza A und B im Spätherbst oder Anfang Januar mit einer vorhersehbaren Saisonalität12. SARS-CoV-2 und Influenzaviren haben zahlreiche epidemiologische Merkmale gemeinsam. Außerdem gibt es Ähnlichkeiten in den anfälligen Bevölkerungsgruppen, zu denen Kinder, ältere Menschen, immungeschwächte Menschen und Personen mit chronischen Komorbiditäten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Herz- und Nierenversagen oder Diabetes gehören12,13. Diese Viren teilen nicht nur gefährdete Bevölkerungsgruppen, sondern auch Übertragungswege und Atemtröpfchen14. Es wird erwartet, dass sich Patienten mit mehr als einem dieser Atemwegsviren infizieren können, wenn sich die Grippesaison dem14. nähert. Dazu muss das Screening auf SARS-CoV-2 und die Influenzaviren bei symptomatischen Patienten durchgeführt werden, bevor sie isoliert werden. Getrennte Tests für die drei Viren (SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B) sind aufgrund des weltweiten Mangels an Ressourcen für die Nukleinsäureextraktion und -diagnostik nicht möglich. Um sie alle in einer Reaktion zu screenen, muss eine Methode oder ein Test entwickelt werden.
Das Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV ist ein Familienmitglied des humanen Coronavirus (CoV). Die ersten MERS-CoV-Virusisolate stammten von einem Krankenhauspatienten in Saudi-Arabien, der im September 2012 an akuten Atemwegserkrankungen gestorben war15. Es gibt Hinweise, die darauf hindeuten, dass ein prominenter Reservoirwirt für MERS-CoV das Dromedar ist. Es ist erwiesen, dass Viren von infizierten Dromedaren zoonotisch sind und somit den Menschen infizieren können16,17. Menschen, die mit diesem Virus infiziert sind, können es durch engen Kontakt auf andere übertragen18. Bis zum 26. Januar 2018 gab es weltweit 2143 laborbestätigte Fälle von MERS-CoV-Infektionen, darunter 750 Todesfälle. Die typischsten MERS-CoV-Symptome sind Husten, Fieber und Kurzatmigkeit. Es wurde auch berichtet, dass MERS-CoV-Infektionen Lungenentzündung, Durchfall und gastrointestinale Krankheitssymptome aufweisen20. Derzeit gibt es keinen kommerziellen Impfstoff oder eine spezifische Behandlung für MERS-CoV. Daher ist eine schnelle und präzise Diagnose unerlässlich, um die weit verbreiteten MERS-CoV-Ausbrüche zu verhindern und MERS-CoV von der SARS-CoV-2-Erkrankung zu unterscheiden.
Bisher wurden viele Ansätze zum Nachweis dieser Viren vorgeschlagen, wie z. B. Multiplex-RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 und CRISPR/Cas329, Lateral-Flow-Immunoassay30, papierbasierte biomolekulare Sensoren31, SHERLOCK-Tests in einem Topf32, DNA-Aptamer33, schleifenvermittelte isotherme Verstärkung (LAMPE)19,34 usw. Jede der oben genannten Methoden hat einzigartige Vor- und Nachteile in Bezug auf Sensitivität und Spezifität. Unter diesen Methoden ist der auf Nukleinsäureamplifikation basierende Test: Multiplex-qRT-PCR, die gebräuchlichste und gilt als Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und MERS-CoV.
In dieser Studie haben wir verschiedene Primer-Kombinationen und Sonden für den effektiven, genauen und gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV unter Verwendung von synthetischen Standard-Twist-Virus-RNAs entwickelt und bewertet. Die Multiplex-Assays, die entweder für MERS-CoV- oder SARS-CoV-2-Zielgene entwickelt wurden, werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfohlen. Diese Gene kodieren im Allgemeinen für Proteine und Komplexe, die zur Bildung eines Replikations-/Transkriptionskomplexes (RTC)35 beitragen, wie z. B. die Region innerhalb des offenen Leserahmens 1a (ORF1a), die für den MERS-CoV-Assay verwendet wird. Darüber hinaus werden Strukturproteine von den Genen kodiert, die in diagnostischen Assays verwendet werden, wie z. B. die Upstream-Region des Hüllgens (upE) und das Nukleokapsid-Gen (N), die für MERS-CoV- bzw. SARS-Cov-2-Assays verwendet werden35,36. Wir verwendeten das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T, um die RT-qPCR für den Nachweis von Viren zu etablieren37. Der Virusnachweis, die Sensitivität, die Spezifität und der dynamische Bereich unseres einstufigen RT-qPCR-Kits und der Primer-Sets R3T wurden mit 10-fachen seriellen Verdünnungen der synthetischen Standard-Twist-RNAs getestet und bewertet. Die niedrigste praktische Nachweisgrenze lag bei etwa 10 Transkriptkopien pro Reaktion. Dadurch können das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T und die Primer/Sonden-Sets erfolgreich für die routinemäßige gleichzeitige Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, eingesetzt und implementiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der hohen Infektions- und Sterblichkeitsraten aufgrund der Ausbreitung gängiger Atemwegsviren wie SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV-Varianten 12,19,20 besteht weltweit eine hohe wirtschaftliche Belastung für das Gesundheitssystem. Motiviert durch das Verantwortungsbewusstsein, diese Belastung zu verringern, erkannten wir die Notwendigkeit eines schnellen, präzisen und zugänglichen diagnostischen Assays wie RT-q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der King Abdullah University of Science and Technology durch eine Grundfinanzierung und die National Term Grand Challenge (NTGC) an S.M.H.
Materials
| 0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
| 6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
| Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
| Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Protein marker | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
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