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Biologie

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Abstract

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una grave amenaza para la salud pública en general. Durante las temporadas de influenza, la propagación del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios puede causar una carga de enfermedades respiratorias en toda la población que es difícil de manejar. Para ello, los virus respiratorios SARS-CoV-2, gripe A, gripe B y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) deberán vigilarse cuidadosamente en las próximas temporadas de otoño e invierno, especialmente en el caso del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B, que comparten factores epidemiológicos similares como las poblaciones susceptibles, el modo de transmisión y los síndromes clínicos. Sin ensayos específicos de objetivos, puede ser difícil diferenciar entre los casos de estos virus debido a sus similitudes. En consecuencia, un ensayo múltiple sensible y dirigido que pueda diferenciar fácilmente entre estas dianas virales será útil para los profesionales sanitarios. En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando un kit de RT-qPCR de un solo paso R3T desarrollado internamente para la detección simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con tan solo 10 copias de sus ARN sintéticos, podemos identificar con éxito los objetivos del SARS-CoV-2, la gripe A, la gripe B y el MERS-CoV simultáneamente con un 100% de especificidad. Se ha comprobado que este ensayo es preciso, fiable, sencillo, sensible y específico. El método desarrollado se puede utilizar como un ensayo de diagnóstico optimizado para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV en hospitales, centros médicos y laboratorios de diagnóstico, así como con fines de investigación.

Introduction

La pandemia de la actual enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) está causada por el nuevo coronavirus conocido como coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)1. Debido a la fuerte contagiosidad del SAR-CoV-2 y a su capacidad de transmisión rápida, la pandemia de COVID-19 surgió en la ciudad de Wuhan, China, y se propagó rápidamente por todo el mundo. Con el tiempo, esto condujo al inicio de signos de dificultad respiratoria e incluso a la muerte 2,3,4. La COVID-19 ha sido declarada pandemia en más de 213 países, previéndose un fuerte aumento en el número de casos confirmados, como lo demuestran los trabajos publicados por diferentes estudios de investigación 3,5. El COVID-19 se transmite principalmente por pequeñas gotitas respiratorias que las personas infectadas liberan al medio ambiente y luego se exponen a las personas vulnerables a través de la inhalación o el contacto cercano con superficies contaminadas. Cuando estas gotitas entran en contacto con la mucosa de los ojos, la boca o la nariz, una persona puede infectarse6. Las estadísticas publicadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) muestran que ha habido más de 76 millones de casos confirmados de la pandemia en todo el mundo, con la asombrosa cifra de 7 millones de muertes7. Así, las Naciones Unidas clasificaron la pandemia causada por la enfermedad COVID-19 como un desastre debido a su impacto directo en la vida de miles de millones de personas en todo el mundo y tuvo efectos económicos, ambientales y sociales de gran alcance.

Se ha demostrado que las iniciativas de salud pública, incluidas las pruebas exhaustivas, la detección temprana, el rastreo de contactos y el aislamiento de casos, son cruciales para mantener esta pandemia bajo control 8,9,10,11. Los meses de invierno aumentarán la circulación de otros virus respiratorios como la influenza A y B con síntomas similares a los de COVID-19, lo que dificultará la identificación, el seguimiento y el aislamiento temprano de los casos de COVID-19. Cada año, el brote de influenza A y B comienza a fines del otoño o principios de enero con una estacionalidad predecible12. Numerosos rasgos epidemiológicos son compartidos por los virus SARS-CoV-2 y Influenza. Además, comparte similitudes en las poblaciones susceptibles, que incluyen niños, ancianos, inmunodeprimidos e individuos con comorbilidades crónicas como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca y renal o diabetes12,13. Estos virus no solo comparten poblaciones vulnerables, sino también vías de transmisión de contacto y gotitas respiratorias14. Se anticipa que es probable que los pacientes contraigan más de uno de estos virus respiratorios a medida que se acerca la temporada de influenza14. Para ello, es necesario realizar el cribado del SARS-CoV-2 y de los virus de la gripe en pacientes sintomáticos antes de aislarlos. No es posible realizar pruebas separadas para los tres virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) debido a la falta mundial de recursos para la extracción y el diagnóstico de ácidos nucleicos. Con el fin de examinarlos todos en una sola reacción, es necesario desarrollar un método o prueba.

El síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV es un miembro de la familia del coronavirus humano (CoV). Las primeras cepas aisladas del virus MERS-CoV procedían de un paciente hospitalizado en Arabia Saudí que había fallecido en septiembre de 2012 debido a problemas respiratorios agudos15. Hay pruebas que sugieren que un huésped importante del MERS-CoV son los dromedarios. Se ha comprobado que los virus de dromedarios infectados son zoonóticos y, por lo tanto, pueden infectar a los humanos16,17. Los seres humanos infectados con este virus pueden transmitirlo a otras personas a través del contacto cercano18. Hasta el 26 de enero de 2018, se habían registrado 2143 casos de infección por MERS-CoV confirmados mediante pruebas de laboratorio, incluidas 750 muertes en todo elmundo. Los síntomas más típicos del MERS-CoV son tos, fiebre y dificultad para respirar. También se ha notificado que las infecciones por MERS-CoV presentan síntomas de neumonía, diarrea y enfermedades gastrointestinales20. En la actualidad, no se dispone de una vacuna comercial ni de un tratamiento específico para el MERS-CoV. Por lo tanto, el diagnóstico rápido y preciso es esencial para prevenir los brotes generalizados de MERS-CoV y diferenciar el MERS-CoV de la enfermedad por SARS-CoV-2.

Hasta la fecha, se han propuesto muchos enfoques para detectar estos virus, como la RT-PCRmultiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 y CRISPR/Cas329, inmunoensayo de flujo lateral30, sensores biomoleculares en papel31, pruebas SHERLOCK en un bote32, aptámero de ADN33, isoterma mediada por bucle amplificación (LAMP)19,34, etc. Cada uno de los métodos mencionados anteriormente tiene ventajas e inconvenientes únicos en términos de sensibilidad y especificidad. Entre estos métodos, la prueba basada en la amplificación de ácidos nucleicos: qRT-PCR multiplex, es la más común y se considera el estándar de oro para el diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B y MERS-CoV.

En este estudio, diseñamos y evaluamos varias combinaciones de cebadores y sondas para la detección efectiva, precisa y simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando ARN virales sintéticos de torsión estándar. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda los ensayos multiplexados desarrollados para los genes diana del MERS-CoV o del SARS-CoV-2. Por lo general, estos genes codifican proteínas y complejos que contribuyen a la formación de un complejo de replicación/transcripción (RTC)35, como la región dentro del marco de lectura abierto 1a (ORF1a) que se utiliza para el ensayo del MERS-CoV. Además, las proteínas estructurales están codificadas por los genes utilizados en los ensayos de diagnóstico, como la región ascendente del gen de la envoltura (upE) y el gen de la nucleocápside (N), que se utilizan para los ensayos de MERS-CoV y SARS-Cov-2, respectivamente35,36. Utilizamos el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T para establecer la RT-qPCR para la detección de virus37. La detección de virus, la sensibilidad, la especificidad y el rango dinámico de nuestro kit de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores se probaron y evaluaron utilizando diluciones en serie de 10 veces de los ARN sintéticos de torsión estándar. El límite de detección práctico más bajo fue de aproximadamente 10 copias de transcripción por reacción. Como resultado, el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores/sondas se pueden utilizar e implementar con éxito para el diagnóstico simultáneo rutinario de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Expresión y purificación de la polimerasa Taq Construya un plásmido con una etiqueta de hexa-histidina escindible en el extremo C de la enzima. Transformar 50 ng del vector de expresión en cepa BL21-(DE3) de E. coli siguiendo el protocolo estándar38. Inocular las células transformadas en cuatro matraces de 6 L, cada uno de los cuales contiene 2 L de caldo de 2YT a 37 °C con agitación a 170 rpm hasta alcanzar el OD 600 de 0,8 o el n…

Representative Results

En los últimos años, se han producido avances significativos en el abordaje diagnóstico para la detección de virus respiratorios comunes mediante abordajes de PCR 21,22,23,24,25. Sin embargo, a pesar de estos avances, el enfoque multiplexado, que permite detectar múltiples virus en una sola prueba, no se ha implementado ampliamente, particularmente en la …

Discussion

Existe una pesada carga económica para el sistema de salud en todo el mundo como resultado de las altas tasas de infección y mortalidad debido a la propagación de virus respiratorios comunes como el SARS-CoV-2, la influenza A/B y las variantes del MERS-CoV 12,19,20. Motivados por el sentido de responsabilidad para aliviar esta carga, nos dimos cuenta de la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, preciso y accesible, c…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de fondos básicos y el National Term Grand Challenge (NTGC) a S.M.H.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
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