Her præsenterer vi en protokol til undersøgelse af hastigheden af programmeret celledødsinitiering ved kontinuerligt at afbilde podede blade efter induktion af celledød.
Overfølsom respons (HR)-tildelt resistens er et effektivt forsvarsrespons, der kan bestemmes af N-resistensgenerne. HR manifesteres som dannelsen af celledødszoner på inokulerede blade. Her præsenteres en protokol til undersøgelse af hastigheden af celledødsinitiering ved billeddannelse af inokulerede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet ved hjælp af et digitalt mikroskop. Det digitale mikroskop muliggør en kontinuerlig billeddannelsesproces i ønskede intervaller, hvilket muliggør en nøjagtig bestemmelse af celledødsinitieringshastighed op til minutter nøjagtigt i modsætning til timer i traditionelle metoder. Billeddannelse med det digitale mikroskop er også uafhængig af lys og kan derfor bruges dag og nat uden at forstyrre plantens døgnrytme. Forskellige patosystemer, der resulterer i programmeret celledødsudvikling, kunne undersøges ved hjælp af denne protokol med mindre ændringer. Samlet set tillader protokollen således enkel, nøjagtig og billig identifikation af initieringsrate for celledød.
Kartoffel er en af verdens mest dyrkede fødevareafgrøder, fjerdepladsen bag ris, hvede og majs. Kartoffelproduktionen kan dog blive hårdt ramt af kartoffelvirus Y (PVY), som i øjeblikket betragtes som dets vigtigste viruspatogen 1,2. I kartoffelplanter cv. Rywal, flere stammer af PVY (herunder PVY-stamme N-Wilga) udløser overfølsom respons (HR)-tildelt resistens, hvor patogenets begrænsning til infektionsstedet manifesterer sig som nekrotiske læsioner på podede blade3. I dette patosystem medieres HR af Ny-1-resistensgenet, som er temperaturafhængigt, da planter, der dyrkes ved lavere temperaturer, effektivt udvikler nekrotiske læsioner, mens abort af resistens i planter, der dyrkes konstitutivt ved forhøjet (28 °C) temperatur, påvises som manglende læsionsdannelse og systemisk virusspredning 3,4. Når planterne overføres til en lavere temperatur (22 °C), initieres celledød, som kan udnyttes til at følge hastigheden af celledødsinitiering ved at afbilde podede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet.
Denne protokol demonstrerer en simpel metode til bestemmelse af initieringsrate for celledød ved hjælp af et digitalt mikroskop. Ved at tage billeder af de podede blade efter overførsel af planten fra 28 °C til 22 °C muliggør et digitalt mikroskop kontinuerlig observation af bladet i ønskede intervaller. I modsætning til brugen af andre metoder (for eksempel konfokal mikroskopi eller observation af læsionsdannelse med det blotte øje) tillader dette bestemmelse af det nøjagtige tidspunkt for læsionsdannelse og derfor celledødsinitieringshastigheden op til minutter nøjagtigt i modsætning til timer i ovennævnte metoder 5,6. Brug af digitale mikroskoper er også uafhængig af lys og kan derfor bruges dag og nat. Denne protokol kan også bruges til at identificere komponenter, der er involveret i initiering af celledød, eller til at bestemme virkningerne af forskellige komponenter på initieringshastigheden for celledød, hvis brugte planter er transgene og har ændrede niveauer af komponenter af interesse.
Den demonstrerede protokol giver brugeren mulighed for nøjagtigt at bestemme initieringshastigheden for celledød ved kontinuerligt at afbilde podede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet ved hjælp af et digitalt mikroskop. Selvom der er mange måder at overvåge læsioner og plantesygdomsforekomst12,13,14,15 på, præsenterer denne protokol fordelen ved lysuafhængig måling uden at forstyrre plantens døgnrytme, da lyset slukkes mellem målingerne.
Efter podningen skal planterne vokse ved 28 °C i 3 dage. Ny-1-resistensgenet , som inducerer et overfølsomt respons, er temperaturafhængigt, og i planter dyrket ved højere temperaturer fører det til abort af resistens, hvilket manifesteres som mangel på læsionsdannelse og systemisk virusspredning3. Efter at planter er overført til 22 ° C, påbegyndes celledød, så for nøjagtige resultater skal observation med et digitalt mikroskop begynde så hurtigt som muligt efter denne overførsel. Et andet afgørende trin i forberedelsen af planten til billeddannelse er immobilisering af bladet (figur 1D), da planten vil fortsætte med at vokse under billeddannelse, hvilket kan flytte det observerede blad ud af fokus, eller en sådan opsætning vil ikke give de ønskede resultater.
Hvis den beskrevne protokol anvendes på transgene planter med ændrede komponenter af interesse, der antages at være involveret i initiering af celledød, gør protokollen det muligt for brugeren at bestemme, om det nedsatte niveau af en undersøgt komponent påvirker hastigheden af celledødsinitiering. Dermed kan komponenter, der er involveret i initiering af celledød, identificeres i patosystemer, hvor programmeret celledød forekommer ved hjælp af denne protokol. Andre metoder til at identificere disse komponenter er for eksempel transkriptomisk analyse såsom RNA-seq eller forskellige former for mikroskopi, hvilket kan være dyrt og tidskrævende16. Metoden beskrevet i denne protokol giver mulighed for nem og billig identifikation af komponenter, der er involveret i initiering af celledød, ved at observere forskelle i initieringshastigheder for celledød mellem transgene planter og kontrolplanter. Optimalt set skal der i et sådant set-up anvendes to digitale kameraer, da et transgent anlæg skal analyseres parallelt med et kontrolanlæg inden for samme forsøg.
I denne protokol blev PVY-stammen N-Wilga anvendt; dog kan andre stammer af denne virus, for eksempel GFP-mærket PVY (PVY-N605 (123) -GFP)7, også anvendes. Desuden kunne andre patosystemer, som resulterer i programmeret celledødsudvikling, undersøges ved hjælp af denne protokol med mindre modifikationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Barbara Jaklič for teknisk bistand. Denne forskning blev støttet økonomisk af det slovenske forsknings- og innovationsagentur (forskningskernefinansiering nr. P4-0165 og projekt Z4-3217: Deciphering redox-related signaling interconnectedness in potato resistance against viruses).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |