Här presenterar vi ett protokoll för att studera graden av programmerad celldödsinitiering genom att kontinuerligt avbilda inokulerade blad efter celldödsinduktion.
Hypersensitivt svar (HR)-konfedererat motstånd är ett effektivt försvarssvar som kan bestämmas av N-resistensgenerna . HR manifesteras som bildandet av celldödszoner på inokulerade blad. Här presenteras ett protokoll för att studera graden av celldödsinitiering genom att avbilda inokulerade blad under tiden mellan celldödsinitieringen och celldödens uppkomst med hjälp av ett digitalt mikroskop. Det digitala mikroskopet möjliggör en kontinuerlig avbildningsprocess i önskade intervall, vilket möjliggör en exakt bestämning av celldödens initieringshastighet upp till minuter exakt, i motsats till timmar i traditionella metoder. Avbildning med det digitala mikroskopet är också oberoende av ljus och kan därför användas dag och natt utan att störa växtens dygnsrytm. Olika patosystem som resulterar i programmerad celldödsutveckling kan studeras med hjälp av detta protokoll med mindre modifieringar. Sammantaget möjliggör protokollet således enkel, exakt och billig identifiering av initieringshastigheten för celldöd.
Potatis är en av världens mest odlade livsmedelsgrödor, på fjärde plats efter ris, vete och majs. Potatisproduktionen kan dock påverkas kraftigt av potatisvirus Y (PVY), som för närvarande anses vara den viktigaste viruspatogenen 1,2. I potatisplantor cv. Rywal, flera stammar av PVY (inklusive PVY-stammen N-Wilga) utlöser resistens som orsakas av hypersensitivt svar (HR), där patogenens begränsning till infektionsstället manifesterar sig som nekrotiska lesioner på inokulerade blad3. I detta patosystem medieras HR av Ny-1-resistensgenen, som är temperaturberoende, eftersom växter som odlas vid lägre temperaturer effektivt utvecklar nekrotiska lesioner, medan i växter som odlas konstitutivt vid förhöjd (28 °C) temperatur, visar sig resistensabort som avsaknad av lesionsbildning och systemisk virusspridning 3,4. När plantorna överförs till en lägre temperatur (22 °C) initieras celldöd, vilket kan utnyttjas för att följa graden av celldödsinitiering genom att avbilda inokulerade blad under tiden mellan celldödsinitieringen och celldödens framträdande.
Detta protokoll demonstrerar en enkel metod för bestämning av initieringshastigheten för celldöd med hjälp av ett digitalt mikroskop. Genom att avbilda de inokulerade bladen efter att ha flyttat växten från 28 °C till 22 °C möjliggör ett digitalt mikroskop kontinuerlig observation av bladet i önskade intervall. Till skillnad från användningen av andra metoder (till exempel konfokalmikroskopi eller observation av lesionsbildning med blotta ögat) möjliggör detta bestämning av den exakta tidpunkten för lesionsbildning och därmed initieringshastigheten för celldöd upp till minuter exakt, i motsats till timmar i tidigare nämnda metoder 5,6. Användningen av digitala mikroskop är också oberoende av ljus och kan därför användas dag och natt. Detta protokoll kan också användas för att identifiera komponenter som är involverade i initiering av celldöd eller för att bestämma effekterna av olika komponenter på initieringshastigheten för celldöd om använda växter är transgena och har förändrade nivåer av komponenter av intresse.
Det demonstrerade protokollet gör det möjligt för användaren att exakt bestämma initieringshastigheten för celldöd genom att kontinuerligt avbilda inokulerade blad under tiden mellan celldödsinitieringen och celldödens utseende med hjälp av ett digitalt mikroskop. Även om det finns många sätt att övervaka förekomst av skador och växtsjukdomar12,13,14,15, har detta protokoll fördelen att det kan mätas oberoende av ljus utan att störa växtens dygnsrytm, eftersom ljuset släcks mellan mätningarna.
Efter vaccinationen ska plantorna växa vid 28 °C i 3 dagar. Ny-1-resistensgenen , som inducerar en överkänslig respons, är temperaturberoende och i växter som odlas vid högre temperaturer leder den till abort av resistens, vilket yttrar sig som utebliven lesionsbildning och systemiskvirusspridning. Efter att växterna har överförts till 22 °C initieras celldöd, så för korrekta resultat bör observationen med ett digitalt mikroskop påbörjas så snart som möjligt efter denna överföring. Ett annat viktigt steg i förberedelsen av växten för avbildning är immobiliseringen av bladet (Figur 1D), eftersom växten kommer att fortsätta att växa under avbildningen, vilket kan flytta det observerade bladet ur fokus, eller så kommer en sådan uppsättning inte att ge önskat resultat.
Om det beskrivna protokollet används på transgena växter med förändrade komponenter av intresse, som antas vara involverade i initiering av celldöd, gör protokollet det möjligt för användaren att avgöra om den minskade nivån av en studerad komponent påverkar graden av celldödsinitiering. På så sätt kan komponenter som är involverade i initiering av celldöd identifieras i patosystem, där programmerad celldöd inträffar, med hjälp av detta protokoll. Andra metoder för att identifiera dessa komponenter är till exempel transkriptomisk analys som RNA-seq eller olika former av mikroskopi, vilket kan vara dyrt och tidskrävande. Metoden som beskrivs i detta protokoll möjliggör enkel och billig identifiering av komponenter som är involverade i initiering av celldöd genom att observera skillnader i initieringshastigheter för celldöd mellan transgena växter och kontrollväxter. Optimalt, i en sådan uppställning, måste två digitalkameror användas, eftersom en transgen anläggning bör analyseras parallellt med en kontrollanläggning inom samma experiment.
I detta protokoll användes PVY-stammen N-Wilga; Andra stammar av detta virus, t.ex. GFP-märkt PVY (PVY-N605(123)-GFP)7, kan dock också användas. Dessutom kan andra patosystem, som resulterar i programmerad celldöd, studeras med hjälp av detta protokoll med mindre modifiering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Barbara Jaklič för den tekniska hjälpen. Denna forskning stöddes ekonomiskt av den slovenska forsknings- och innovationsbyrån (forskningsbasfinansiering nr P4-0165 och projekt Z4-3217: Dechiffrera redoxrelaterad signalering interconnectedness i potatisresistens mot virus).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |