Detta protokoll beskriver en uppställning för kristallisation av steroltransportören ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueras till biceller för hängdroppskristallisation. Protokollet kräver inga specialiserade material eller substrat, vilket gör det tillgängligt och lätt att anpassa i alla laboratorier för att bestämma proteinstrukturen genom röntgenkristallografi.
ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) utgör lipidinbäddade membranproteiner. Extraktion av dessa membranproteiner från lipiddubbelskiktet till en vattenhaltig miljö uppnås vanligtvis genom att använda rengöringsmedel. Dessa rengöringsmedel sönderdelar lipiddubbelskiktet och löser proteinerna. Den inneboende livsmiljön för membranproteiner i lipiddubbelskiktet utgör en utmaning när det gäller att upprätthålla deras stabilitet och enhetlighet i lösning för strukturell karakterisering. Biceller, som består av en blandning av lång- och kortkedjiga fosfolipider och rengöringsmedel, replikerar den naturliga lipidstrukturen. Användningen av lipidbiceller och tvättmedel fungerar som ett lämpligt modellsystem för att erhålla diffraktionskristaller av hög kvalitet, speciellt för att bestämma den högupplösta strukturen hos membranproteiner. Genom dessa syntetiska mikromiljöer bevarar membranproteiner sin ursprungliga konformation och funktionalitet, vilket underlättar bildandet av tredimensionella kristaller. I detta tillvägagångssätt återintegrerades den tvättmedelslösliga heterodimeriska ABCG5/G8 i DMPC/CHAPSO-biceller, kompletterad med kolesterol. Denna uppställning användes i den experimentella ångdiffusionsproceduren för proteinkristallisation.
ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) utgör en superfamilj av membranproteiner som ansvarar för olika ATP-beroende transportprocesser över biologiska membran 1,2,3,4,5. Dessa transportproteiner är inblandade i hjärt-kärlsjukdomar och spelar en viktig roll för att underlätta kolesterolutflödet till gallan för efterföljande utsöndring i levern. Följaktligen har kolesterolmetabolism och kolesterolbalans väckt stort intresse under årenslopp 6. En specifik mekanism som är involverad i elimineringen av kolesterol och andra steroler från kroppen involverar medlemmar av den humana ABCG-underfamiljen, särskilt den heterodimera ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutationer i någon av dessa gener stör heterodimeren, vilket leder till funktionsförlust och orsakar sitosterolemi, en sjukdom som påverkar sterolhandeln11,12,13. Med tanke på sjukdomens relevans och deras roll för att främja kolesterolutflöde har steroltransportörer väckt stor uppmärksamhet. Ändå är de intrikata detaljerna i deras molekylära mekanism och substratselektivitet i stort sett inte avslöjade. Således är klargörandet av kristallstrukturen hos ABCG5/G8 ett avgörande steg mot att förstå mekanismerna och nedströmsfunktionerna i kolesteroltransport.
Membranproteiner kräver förankring i membran för att veckas och fungera korrekt. Följaktligen resulterar extraktion av membranproteiner från deras naturliga miljö ofta i proteininstabilitet, felveckning och förlust av funktion14,15. Dessa utmaningar understryker de primära hindren för kristallisering av membranproteiner. Emellertid har rekonstituering av proteiner till syntetiska tvättmedelsskikt, som biceller, visat sig vara en lösning på detta problem, vilket gör det möjligt att upprätthålla membranproteiner i en naturligt liknande dubbelskiktsmiljö. Biceller är sammansättningar av syntetiska fosfolipider och rengöringsmedel suspenderade och solubiliserade i vatten. Noterbart är att de antar en tvåskiktsstruktur som efterliknar biologiska membran16,17,18. Biceller kan övergå mellan vätske- och gelfaser baserat på temperatur och viskositet. Bicellkristallisering drar nytta av de små tvåskiktsskivorna och den låga viskositeten vid reducerade temperaturer, vilket underlättar en grundlig blandning av proteiner och bicellelösningar. Storleken på bicellerna beror på förhållandet mellan tvättmedel och lipider under beredningen19,20. De vanligaste tvättmedlen för bicellbildning inkluderar 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-2-hydroxi-1-propansulfonat (CHAPSO), tillsammans med 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) och 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-fosfokolin (DHPC)21. Dessa rengöringsmedel används tillsammans med lipider som di-myristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylkolin (POPC). Dessutom har nyligen genomförda studier visat att membranproteiner i biceller fungerar fullt ut under fysiologiska förhållanden. Till exempel har Lee och kollegor framgångsrikt kristalliserat och rapporterat kristallstrukturen för ABCG5/ABCG8 baserat på ett lipiddubbelskikt22,23. I kristallisationsprocessen kan protein-bicelleblandningar anpassas med hjälp av standardutrustning, inklusive kristallisationsrobotar med hög genomströmning24. Möjligheten att använda biceller beror dock på proteinernas termostabilitet på grund av kristallisationsförhållandena vid högre temperaturer. Icke desto mindre, jämfört med andra tekniker, förblir de nödvändiga kristallisationsförhållandena för membranproteiner i allmänhet milda, med låga koncentrationer av fällningsmedel, salt och buffert. Detta gör både protein-bicelleblandningar och ångdiffusion till effektiva och lättimplementerade verktyg för strukturstudier av membranproteiner.
Detta protokoll beskriver viktiga steg i proteinberedning och bicellkristallisation för att bestämma röntgenkristallstrukturen för ABCG5/G8 med hög upplösning (figur 1).
De utmaningar som är förknippade med kristalliserande membranproteiner har föranlett utvecklingen av lipid-dubbelskiktsdrivna kristallisationsmetoder, såsom bicelle27 eller lipidkubisk fas (LCP)14-metoder . Att uppnå framgångsrik kristallisation av membranproteiner är dock fortfarande beroende av det kritiska och ibland flaskhalsade steget i proteinframställningen. Noterbart är att ABC-transportörer utgör ett formidabelt hinder för att odla kristaller som är lämpliga för röntgenkristallografi. Detta protokoll ger omfattande praktisk vägledning för att effektivisera beredningen av human ABCG5/G8-steroltransportör och främja kristalltillväxt genom bicellekristallisationsmetoden.
En viktig faktor vid utformningen av detta protokoll var nödvändigheten av ett betydande proteinutbyte i de inledande faserna av proteinrening, vilket möjliggör en viss grad av proteinförlust under förkristallisationsbehandling (figur 3). Vanliga strategier för att ta itu med denna utmaning involverar omfattande proteinteknik, användning av olika uttrycksvärdar och utforskning av ortologer eller homologer, bland andra metoder. Icke desto mindre, med denna till synes invecklade procedur, har ett antal avgörande steg identifierats som stöder protokollets framgång och även ger insikter om potentiella begränsningar som kan uppstå när man studerar andra ABC-transportörer eller membranproteiner i allmänhet.
För det första använder detta protokoll noggrann centrifugering vid varje steg för att minimera proteinaggregeringen. Dessutom är kontinuerlig övervakning av de renade proteinernas termostabilitet avgörande. Elektronmikroskopi används för att verifiera proteinets monodispersitet, medan analytisk gelfiltrering spårar proteinstabilitet över tid (figur 2). Alternativa tekniker som cirkulär dikroism (CD) eller differentiell skanningskalorimetri (DSC) kan också införlivas. Dessutom är inkorporering av lipider i specifika stadier avgörande för att maximera både aktiviteten och kristallogenesen av den renade ABCG5/G8. Till exempel är kolat och CHS nödvändiga för att uppvisa mätbar ATP-hydrolys; fosfolipider är oumbärliga för att upprätthålla stabiliteten hos metylerade proteiner; och kolesterol är en nödvändig komponent i bicellelösningen, vilket främjar kristalltillväxt som är lämplig för högupplöst röntgendiffraktion (figur 4).
I huvudsak kan hela proceduren utföras inom en veckas ansträngning. Till skillnad från LCP är det enkelt att hämta kristaller från kristallisationsbrickor med hängande droppar. Med ett betydande proteinutbyte (cirka 10 mg) är detta protokoll lätt att anpassa för att utveckla kristallografiska undersökningar som involverar ABCG5/G8-mutanter eller andra transportproteiner. Detta är särskilt relevant för fall som för närvarande undgår visualisering genom elektronmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ett Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) och ett Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) till JYL. Detta protokoll är baserat på de ursprungliga rapporterna i ABCG5/G8 kristallstrukturer som tidigare rapporterats av Farhat et al.22 och Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |