Esplorare le scelte della storia di vita: utilizzare la temperatura e il tipo di substrato come fattori interagenti per le preferenze larvali e femminili del moscone

Summary

In questo articolo, vengono descritti in dettaglio due protocolli per valutare la fonte di cibo e le preferenze di ovideposizione nelle larve e nelle femmine di mosconi. Questi comprendono quattro scelte con due fattori interagenti: il tipo di substrato e la temperatura. I saggi consentono di determinare la preferenza per la fonte di cibo delle larve e la preferenza per il sito di ovideposizione per le femmine.

Abstract

I mosconi (Diptera: Calliphoridae) presentano una vasta gamma di stili di vita larvali, tipicamente classificati come parassitismo obbligato, parassitismo facoltativo e sapro-necrofagia completa. Diverse specie parassite, sia obbligate che facoltative, sono considerate di importanza sanitaria ed economica, in quanto le loro larve possono causare miasi (infestazione da vermi nei tessuti vivi). Tuttavia, è interessante notare che la femmina adulta gioca un ruolo decisivo nella scelta del sito di ovideposizione e, quindi, determina in gran parte l’abitudine alimentare e le condizioni di sviluppo delle larve. In questo studio, vengono proposti due protocolli per testare la preferenza per l’alimentazione larvale e la preferenza per il sito di ovideposizione della femmina considerando due fattori interagenti: il tipo di substrato della carne e la temperatura. Le configurazioni qui presentate hanno permesso di testare le larve di Lucilia cuprina e le femmine gravide in un test a quattro scelte con due temperature (33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C) e due tipi di substrati di carne (carne fresca integrata con sangue e carne marcia di 5 giorni). Le larve o le femmine gravide possono scegliere di scavare o deporre le uova, rispettivamente, in uno dei seguenti modi: carne marcia a 25 °C (che simula una condizione di specie necrofaga), carne fresca integrata con sangue a 33 °C (che simula una condizione di specie parassita) e due controlli, carne marcia a 33 °C o carne fresca integrata con sangue a 25 °C. La preferenza viene valutata contando il numero di larve o uova deposte in ciascuna opzione per ogni replica. Il confronto dei risultati osservati con una distribuzione casuale ha permesso di stimare la significatività statistica della preferenza. I risultati hanno indicato che le larve di L. cuprina hanno una forte preferenza per il substrato marcio a 25 °C. Al contrario, la preferenza del sito di ovideposizione da parte delle femmine era più varia per il tipo di carne. Questa metodologia può essere adattata per testare la preferenza di altre specie di insetti di dimensioni simili. Altre domande possono essere esplorate utilizzando condizioni alternative.

Introduction

Le mosche, in particolare i muscoidi caliptrati (tra cui moscerini, mosche domestiche, mosche bot e moscerini della carne, tra gli altri), mostrano una vasta gamma di stili di vita, che comprendono comportamenti parassiti e necro-saprofagi^. Le specie parassite causano tipicamente la miasi, un’infestazione di tessuti vivi da parte di vermi (larve)². Nella famiglia Calliphoridae, sia le specie parassite obbligate che quelle facoltative sono i principali parassiti del bestiame responsabili di perdite economiche e scarso benessere degli animali a causa di infestazioni di vermi 2,3,4,5,6,7. I parassiti obbligati, come i vermi del Nuovo Mondo e del Vecchio Mondo (rispettivamente Cochliomyia hominivorax e Chrysomyia bezziana), sono particolarmente problematici 4,7,8,9,10 insieme ai parassiti facoltativi, come i moscerini delle pecore (Lucilia cuprina e Lucilia sericata)2,5,6^{, 7}. Introduzione Le specie non parassite, comprese quelle sapro-necrofaghe, si sviluppano nella materia organica in decomposizione e necrotica e si trovano comunemente in ambienti non igienici. Il loro stile di vita rigorosamente non parassitario può essere utilizzato con successo per la terapia dei vermi, che utilizza larve di mosca per pulire le ferite dai tessuti necrotici^11,12,13. I mosconi sono utilizzati anche nella scienza forense, in quanto sono tra i primi organismi a localizzare e colonizzare corpi deceduti di recente, con le larve in via di sviluppo che servono come mezzo per stimare l’ora della morte¹⁴.

Gli stili di vita dei mosconi sono stati oggetto di vari studi di ricerca (ad esempio, 15,16,17,18,19,20,21) a causa della loro importanza in relazione agli interessi umani. Comprendere i meccanismi biologici che governano lo stile di vita di una specie può fornire preziose informazioni per migliorare i metodi volti a controllare le specie nocive. Inoltre, la diversità e l’evoluzione degli stili di vita dei moscerini offrono un contesto ideale per studiare le origini e i meccanismi di tratti complessi (ad esempio, il parassitismo). Il parassitismo dovuto ai vermi che si nutrono di tessuti vivi si è evoluto indipendentemente diverse volte all’interno della famiglia Calliphoridae^22,23. Tuttavia, la storia evolutiva delle abitudini alimentari dei mosconi è ancora in gran parte sconosciuta, con studi limitati a mappare le abitudini lungo le filogenesi (ad esempio, ^16,19,22) senza l’ausilio di saggi funzionali. Ad esempio, non è chiaro se i parassiti obbligati si siano evoluti da generalisti (cioè parassiti facoltativi) o direttamente da specie necrofaghe. Anche i processi molecolari, fisiologici e comportamentali che accompagnano i cambiamenti evolutivi nello stile di vita sono in gran parte sconosciuti.

In questo contesto, parassiti facoltativi, come il moscerino delle pecore Lucilia cuprina, che possono svilupparsi come parassiti su un ospite o come necrofagi su cadaveri, offrono la possibilità di esplorare i fattori e i meccanismi che controllano le scelte di vita. La Lucilia cuprina è una specie cosmopolita nota per causare l’attacco della mosca delle pecore, soprattutto in Australia dove è considerata un parassita ^3,16. La miasi dovuta a L. cuprina può verificarsi anche in altri animali da reddito, animali domestici e nell’uomo 3,24,25,26,27,28,29,30. Tuttavia, le sue larve possono svilupparsi anche nei tessuti necrotici e nella materia in decomposizione e questa specie è stata utilizzata con successo in entomologia forense in quanto è molto veloce nel localizzare e colonizzare i cadaveri ^31,32,33,34. Sebbene lo stile di vita parassitario rispetto a quello non parassitario dei mosconi sia definito dallo stadio larvale, è la femmina adulta che seleziona il sito di ovideposizione. Di conseguenza, la femmina adulta influenza pesantemente lo stile di vita delle larve, in quanto queste ultime hanno una mobilità limitata. Tuttavia, la scelta della femmina non implica necessariamente che le larve preferiscano lo stesso substrato quando si trovano di fronte a una scelta³⁵. Un’ipotesi è che i cambiamenti comportamentali che portano le femmine a deporre le uova su tessuti vivi potrebbero essere parte di un passaggio precoce verso uno stile di vita parassitario. I pre-adattamenti o le capacità fisiologiche delle larve risultanti sarebbero stati essenziali per il loro sviluppo di successo sul tessuto vivo, portando all’emergere dello stile di vita parassitario. Pertanto, i processi interessati e selezionati potrebbero non essere necessariamente allineati tra le due fasi della vita.

In questo contesto, sono stati sviluppati due metodi per testare la preferenza comportamentale nei moscerini, in particolare, per L. cuprina, per quanto riguarda il substrato di alimentazione larvale (saggio di preferenza larvale) e il sito di ovideposizione (saggio di preferenza femminile). Questi metodi tengono conto di due fattori interagenti: la temperatura e la freschezza della carne. La temperatura è stata scelta come fattore cruciale poiché la maggior parte dei casi di miasi si verifica negli animali omeotermi². Pertanto, una temperatura di 33 °C è stata selezionata come proxy per il “fattore di stile di vita parassitario”, mentre una temperatura di 25 °C (temperatura ambiente) rappresenta il “fattore non parassitario”. È stata scelta una temperatura di 25 °C in quanto rappresentativa della temperatura media annua registrata in Brasile (Istituto Nazionale di Meteorologia, INMET). Inoltre, sono stati presi in considerazione due tipi di substrati di carne, entrambi di origine bovina: (i) carne fresca integrata con sangue, che imita il substrato per lo stile di vita parassitario, che viene utilizzato per allevare il moscone parassita Co. hominivorax in condizioni di laboratorio³⁶, e (ii) carne marcia di 5 giorni, che emula il substrato per lo stile di vita necrofago. Il substrato bovino è comunemente utilizzato per l’allevamento di L. cuprina in condizioni di laboratorio 27,37,38,39 in quanto offre numerosi vantaggi in termini di disponibilità, economicità e praticità pur essendo un substrato ecologicamente giustificabile. Altri studi^40,41 che confrontano l’effetto dei substrati marci rispetto a quelli freschi nei mosconi hanno utilizzato substrati marci di 7 giorni (in condizioni anaerobiche) e hanno mostrato un effetto negativo del substrato marcio sui tassi di sviluppo, sopravvivenza e crescita. Poiché L. cuprina è nota per colonizzare cadaveri freschi che di solito sono esposti all’aria, abbiamo deciso di utilizzare carne marcia di 5 giorni (carne macinata) in vasi non ermetici (decomposizione aerobica e anaerobica) per imitare un substrato necrofago.

I disegni sperimentali qui presentati offrono il vantaggio di discernere le preferenze per i singoli fattori e i loro effetti combinati. Inoltre, i fenotipi valutati, vale a dire la scelta del substrato di alimentazione larvale e il numero di uova deposte, sono direttamente rilevanti per gli aspetti biologici ed ecologici delle specie di moscerini. L’idoneità di questi protocolli è evidenziata dimostrando la loro efficacia in L. cuprina. Inoltre, viene fornito uno script per l’analisi statistica, che può essere utilizzato per confrontare i risultati osservati ottenuti in L. cuprina con dati casuali simulati, garantendo solide analisi statistiche e interpretazioni.

Protocol

I campioni di mosca sono stati ottenuti utilizzando trappole e non su animali infestati. È stata rilasciata una licenza SISBIO (67867-1) per la raccolta e la detenzione di mosche della famiglia Calliphoridae in cattività in condizioni di laboratorio. I campioni di insetti sono esenti da valutazione etica nella ricerca in Brasile. La carne e il sangue bovino sono stati ottenuti commercialmente e non è stata richiesta alcuna autorizzazione etica. 1. Preferenza per l’alimentazione larval…

Representative Results

Per dimostrare l’efficacia dei metodi presentati, gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una popolazione di laboratorio di Lucilia cuprina (famiglia: Calliphoridae), un moscone parassita facoltativo2. L’intero set di dati grezzi ottenuto per questa specie può essere trovato nel file supplementare S3 con i risultati dei test di preferenza del substrato larvale e femminile. Per valutare se le larve e le femmine mostrano una preferenza per qualsiasi substrato, i da…

Discussion

Comprendere l’evoluzione delle abitudini alimentari, in particolare nel contesto del parassitismo nei moscerini, richiede l’esame delle preferenze del substrato durante le diverse fasi della vita per l’alimentazione o l’ovideposizione. Pertanto, in questo studio, sono stati proposti metodi robusti e semplici per studiare le preferenze del substrato nelle larve e nelle femmine di mosconi. Questi metodi sono stati testati in Lucilia cuprina, un moscone parassita facoltativo². È interessant…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)