Utforska livshistorieval: Att använda temperatur och substrattyp som samverkande faktorer för blåsfluglarver och honpreferenser

Summary

Här beskrivs två protokoll för att bedöma födokälla och äggläggningspreferenser hos larver och honor av blåsflugor. Dessa består av fyra val med två samverkande faktorer: substrattyp och temperatur. Analyserna gör det möjligt att bestämma larvernas födokälla och honornas preferens för äggläggningsstället.

Abstract

Blåsflugor (Diptera: Calliphoridae) uppvisar ett brett spektrum av larvlivsstilar, vanligtvis klassificerade som obligat parasitism, fakultativ parasitism och fullständig sapro-nekrofagi. Flera parasitarter, både obligata och fakultativa, anses vara av sanitär och ekonomisk betydelse, eftersom deras larver kan orsaka myiasis (maskangrepp i levande vävnad). Det är dock värt att notera att den vuxna honan spelar en avgörande roll när hon väljer äggläggningsplats och därför till stor del bestämmer larvernas matvanor och utvecklingsförhållanden. I denna studie föreslås två protokoll för att testa larvernas födopreferenser och honornas preferens för äggläggningsställen med hänsyn till två samverkande faktorer: köttsubstrattyp och temperatur. Uppställningarna som presenteras här gjorde det möjligt att testa Lucilia cuprina-larver och dräktiga honor i en fyrvalsanalys med två temperaturer (33 ± 2 °C och 25 ± 2 °C) och två typer av köttsubstrat (färskt kött kompletterat med blod och 5 dagar gammalt ruttet kött). Larver eller dräktiga honor kan välja att gräva eller lägga sina ägg i något av följande: ruttet kött vid 25 °C (simulerat ett tillstånd av en askultativ art), färskt kött som tillförs blod vid 33 °C (simulerat ett parasitarttillstånd) och två kontroller, ruttet kött vid 33 °C eller färskt kött som tillförs blod vid 25 °C. Preferensen bedöms genom att räkna antalet larver eller ägg som läggs i varje alternativ för varje replikat. Genom att jämföra de observerade resultaten med en slumpmässig fördelning kunde man uppskatta den statistiska signifikansen av preferensen. Resultaten indikerade att L. cuprina-larver har en stark preferens för det ruttna substratet vid 25 °C. Omvänt var honornas preferens för äggläggningsstället mer varierad för kötttypen. Denna metod kan anpassas för att testa preferenserna hos andra insektsarter av liknande storlek. Andra frågor kan också undersökas med hjälp av alternativa villkor.

Introduction

Flugor, särskilt kalyptratmuscoider (inklusive blåsflugor, husflugor, botflugor och köttflugor bland andra), uppvisar ett brett spektrum av livsstilar, som omfattar parasitiska och nekro-saprofagiska beteenden¹. Parasitiska arter orsakar vanligtvis myiasis, ett angrepp av levande vävnader av larver (larver)². I familjen Calliphoridae är både obligata och fakultativa parasitiska arter stora skadegörare på boskap som är ansvariga för ekonomiska förluster och dålig djurvälfärd på grund av maskangrepp 2,3,4,5,6,7. Obligata parasiter, såsom skruvmaskar från Nya och Gamla världen (Cochliomyia hominivorax respektive Chrysomyia bezziana), är särskilt problematiska 4,7,8,9,10 tillsammans med fakultativa parasiter, såsom fårblåsflugor (Lucilia cuprina och Lucilia sericata)^{2,5,6, 7}. veckor Icke-parasitiska arter, inklusive sapro-nekrofager, utvecklas i ruttnande och nekrotiskt organiskt material och är vanligt förekommande i ohälsosamma miljöer. Deras strikt icke-parasitiska livsstil kan framgångsrikt användas för maskterapi, som använder fluglarver för att rengöra sår på nekrotiska vävnader^11,12,13. Blåsflugor används också inom kriminalteknik, eftersom de är bland de första organismerna som lokaliserar och koloniserar nyligen avlidna kroppar, med de utvecklande larverna som ett sätt att uppskatta tidpunkten för döden¹⁴.

Blåsflugans livsstil har varit föremål för olika forskningsstudier (t.ex. 15,16,17,18,19,20,21) på grund av deras betydelse i förhållande till mänskliga intressen. Att förstå de biologiska mekanismerna som styr en arts livsstil kan ge värdefulla insikter för att förbättra metoder som syftar till att bekämpa skadedjursarter. Dessutom erbjuder mångfalden och utvecklingen av flugans livsstil ett idealiskt sammanhang för att studera ursprunget och mekanismerna för komplexa egenskaper (t.ex. parasitism). Parasitism på grund av larver som livnär sig på levande vävnad har utvecklats oberoende av varandra flera gånger inom familjen Calliphoridae^22,23. Den evolutionära historien om födovanorna hos blåsflugor är dock fortfarande till stor del okänd, med studier begränsade till att kartlägga vanorna längs fylogenier (t.ex. ^16,19,22) utan hjälp av funktionella analyser. Till exempel är det osäkert om obligata parasiter utvecklades från generalister (dvs. fakultativa parasiter) eller direkt från obdukduka arter. De molekylära, fysiologiska och beteendemässiga processer som åtföljer de evolutionära förändringarna i livsstil är också till stor del okända.

I detta sammanhang erbjuder fakultativa parasiter, såsom blåsflugan Lucilia cuprina, som kan utvecklas som parasiter på en värd eller som obduktioner på kadaver, möjligheten att utforska de faktorer och mekanismer som styr livsstilsval. Lucilia cuprina är en kosmopolitisk art som är känd för att orsaka flugangrepp på får, särskilt i Australien där den anses vara ett skadedjur ^3,16. Myiasis orsakad av L. cuprina kan också förekomma hos andra husdjur, husdjur och människor 3,24,25,26,27,28,29,30. Men dess larver kan också utvecklas i nekrotiska vävnader och ruttnande material och denna art har framgångsrikt använts inom rättsentomologi eftersom den är mycket snabb att lokalisera och kolonisera lik^31,32,33,34. Även om den parasitiska kontra icke-parasitiska livsstilen hos blåsflugor definieras av larvstadiet, är det den vuxna honan som väljer äggläggningsstället. Följaktligen påverkar den vuxna honan i hög grad larvernas livsstil, eftersom de senare har begränsad rörlighet. Honans val innebär dock inte nödvändigtvis att larverna skulle föredra samma substrat när de ställs inför ett val³⁵. En hypotes är att beteendeförändringar som ledde till att honor lade sina ägg på levande vävnad kan ha varit en del av en tidig övergång till en parasitisk livsstil. Föranpassningar eller fysiologiska förmågor hos de resulterande larverna skulle ha varit avgörande för deras framgångsrika utveckling på den levande vävnaden, vilket ledde till uppkomsten av den parasitiska livsstilen. Som sådan kanske de processer som påverkas och väljs inte nödvändigtvis överensstämmer mellan båda livsstadierna.

I detta sammanhang utvecklades två metoder för att testa beteendepreferens hos blåsflugor, i synnerhet för L. cuprina, med avseende på larvfödosubstrat (larvpreferensanalys) och äggläggningsställe (honpreferensanalys). Dessa metoder tar hänsyn till två samverkande faktorer: temperatur och köttets färskhet. Temperatur valdes som en avgörande faktor eftersom de flesta fall av myiasis förekommer hos homeoterma djur². Därför valdes en temperatur på 33 °C som en proxy för den “parasitiska livsstilsfaktorn”, medan en temperatur på 25 °C (rumstemperatur) representerar den “icke-parasitiska faktorn”. En temperatur på 25 °C valdes eftersom den är representativ för den genomsnittliga årstemperaturen som uppmätts i Brasilien (National Institute of Meteorology, INMET). Dessutom övervägdes två typer av köttsubstrat, båda från nötkreatur: (i) färskt kött kompletterat med blod, som efterliknar substratet för den parasitiska livsstilen, som används för att föda upp den parasitiska blåsflugan Co. hominivorax under laboratorieförhållanden³⁶, och (ii) 5 dagar gammalt ruttet kött, som efterliknar substratet för den obduktiva livsstilen. Det bovina substratet används ofta för att föda upp L. cuprina under laboratorieförhållanden 27,37,38,39 eftersom det erbjuder flera fördelar när det gäller tillgänglighet, kostnadseffektivitet och praktiska egenskaper samtidigt som det är ett ekologiskt motiverat substrat. Andra studier^40,41 som jämför effekten av ruttna kontra färska substrat hos blåsflugor har använt 7 dagar gammalt ruttet substrat (under anaeroba förhållanden) och visat en negativ effekt av det ruttna substratet på utvecklingshastighet, överlevnad och tillväxt. Eftersom L. cuprina är känd för att kolonisera färska kadaver som vanligtvis utsätts för luft, bestämde vi oss för att använda 5 dagar gammalt ruttet kött (köttfärs) i icke-hermetiska krukor (aerob och anaerob nedbrytning) för att efterlikna ett obduktörssubstrat.

De experimentella designerna som presenteras här erbjuder fördelen att urskilja preferenser för individuella faktorer såväl som deras kombinerade effekter. Dessutom är de fenotyper som poängsätts, det vill säga valet av larvsubstrat och antalet ägg som läggs, direkt relevanta för de biologiska och ekologiska aspekterna av blåsflugearter. Lämpligheten av dessa protokoll belyses genom att visa deras effektivitet i L. cuprina. Dessutom tillhandahålls ett skript för statistisk analys, som kan användas för att jämföra de observerade resultaten som erhållits i L. cuprina med simulerade slumpmässiga data, vilket säkerställer robust statistisk analys och tolkningar.

Protocol

Flugprover togs med hjälp av fällor och inte på angripna djur. En SISBIO-licens (67867-1) utfärdades för att samla in och hålla flugor av familjen Calliphoridae i fångenskap under laboratorieförhållanden. Insektsprover är undantagna från etisk utvärdering vid forskning i Brasilien. Kött och blod från nötkreatur erhölls kommersiellt, och inget etiskt godkännande krävdes. 1. Larvens födosök Tillagning av petriskålar som innehåller 2 % agar…

Representative Results

För att demonstrera effektiviteten av de presenterade metoderna utfördes experimenten med hjälp av en laboratoriepopulation av Lucilia cuprina (familj: Calliphoridae), en fakultativ parasitisk blåsfluga2. Hela den rådata som erhållits för denna art finns i tilläggsfil S3 tillsammans med resultaten från testerna av larver och honor av substrat. För att bedöma om larverna och honorna visar en preferens för något substrat jämfördes de observerade uppgifterna m…

Discussion

För att förstå utvecklingen av födovanor, särskilt i samband med parasitism hos blåsflugor, krävs undersökning av substratpreferenser under olika livsstadier för utfodring eller äggläggning. Därför föreslogs i denna studie robusta och enkla metoder för att undersöka substratpreferenser hos larver och honor av blåsflugor. Dessa metoder testades i Lucilia cuprina, en fakultativ parasitisk blåsfluga². Intressant nog avslöjade experimenten en tydlig benägenhet för ruttet …

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)