Ce protocole démontre l’isolement guidé par microscopie et la coloration par immunofluorescence des veines pulmonaires murines. Nous préparons des échantillons de tissus contenant l’oreillette gauche, les veines pulmonaires et les poumons correspondants et les colorons pour la troponine T cardiaque et la connexine 43.
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Article de méthode
Microdissection et coloration par immunofluorescence des manchons myocardiques dans les veines pulmonaires murines
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les veines pulmonaires (PV) sont la principale source de battements ectopiques dans les arythmies auriculaires et jouent un rôle crucial dans le développement et la progression de la fibrillation auriculaire (FA). Les PV contiennent des manchons myocardiques (MS) composés de cardiomyocytes. Les SEP sont impliquées dans l’initiation et le maintien de la FA, car elles préservent les similitudes avec le myocarde cardiaque, y compris la capacité de générer des impulsions électriques ectopiques. Les rongeurs sont largement utilisés et peuvent représenter d’excellents modèles animaux pour étudier le myocarde de la veine pulmonaire puisque les cardiomyocytes sont largement présents sur toute la paroi des vaisseaux. Cependant, la microdissection et la préparation précises des PV murins sont difficiles en raison de la petite taille des organes et de l’anatomie complexe.
Nous démontrons un protocole de microdissection guidée par microscopie pour isoler l’oreillette gauche (LA) murine avec les PVs. Une coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps cardiaques à base de troponine-T (cTNT) et de connexine 43 (Cx43) est réalisée pour visualiser le LA et les PV dans leur intégralité. L’imagerie à des grossissements de 10x et 40x fournit une vue complète de la structure PV ainsi que des informations détaillées sur l’architecture myocardique, mettant en évidence en particulier la présence de connexine 43 dans la SEP.
Introduction
La fibrillation auriculaire (FA) est l’arythmie soutenue la plus fréquente1. La prévalence de la fibrillation auriculaire augmente encore avec un nombre attendu de ~17,9 millions de patients en Europe en 20601. La fibrillation auriculaire est cliniquement très importante car elle constitue un facteur de risque essentiel pour le développement d’un infarctus du myocarde, d’une insuffisance cardiaque ou d’un accident vasculaire cérébral, entraînant un énorme fardeau individuel, social et socio-économique1. Même si la fibrillation auriculaire est connue depuis des décennies, la physiopathologie de la ....
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Protocole
Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich, et toutes les procédures utilisant des souris ont été approuvées par la Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Des souris C57BL6/N ont été obtenues dans le commerce.
1. Préparation
- Préparez un gel d’agarose à 3 % en mélangeant 3 mg d’agarose et 100 mL de solution saline tamponnée 1x Tr....
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Résultats
Nous avons effectué la microdissection, la coloration et l’imagerie des PV chez 10 souris âgées de 12 à 16 semaines. En suivant le protocole, nous avons réussi à microdisséquer les PV avec le LA chez toutes les souris expérimentales et avons obtenu des coupes avec une vue complète des PV chez huit souris. Des images d’ensemble ont été prises à un grossissement de 10x pour identifier la région de l’orifice PV (PVO) à la jonction LA-PV, les PV extrapulmonaires (PV ex) (PVentre le hile pulmonaire et la jonction L.......
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Discussion
Avec ce protocole, nous partageons une méthode permettant de distinguer et d’isoler les PV du cœur de souris et d’effectuer une coloration par immunofluorescence sur ceux-ci. Après le prélèvement d’organes, le cœur et les poumons ont été déshydratés dans une solution de saccharose stérilisée, puis séparés les ventricules de l’oreillette et des lobes pulmonaires sous guidage microscopique. Ensuite, la base du cœur a été préparée pour visualiser les PV, puis les a coupées des poumons au niveau du hile. La coloration par im.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK ; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), le China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.), la Fondation allemande pour la recherche (DFG ; Programme de clinicien-chercheur en médecine vasculaire (PRIME), MA 2186/14-1 à P. T.), et la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. C.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lames d’adhésion | Epredia | 10149870 | |
| AF568-anticorps secondaire | Invitrogen | A11036 | Hôte : Chèvre, Réactivité : Agarose de lapin |
| Biozym LE 840104 | |||
| Alexa Fluor 488-anticorps secondaire | Technologie de signalisation cellulaire | 4408S | Hôte : Chèvre, Réactivité : Souris |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 anticorps | Abcam | ab11370 | Anticorps polyclonal, clone : GJA1, hôte : lapin |
| Anticorps anti-cTNT | Invitrogen | MA5-12960 | Anticorps monoclonal, Clone : 13-11, Hôte : Souris |
| Sérum bovin albumine | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas ; | 5486 | taille 6 |
| Couvre-slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia ; | Réglages : Température de l’échantillon : -18 ° ; C, température de la lame : -25 ° ; C | |
| DFC365FX appareil photo | Leica ; | ||
| Microscope à fluorescence DM6 B | Leica ; | ||
| Glace | |||
| Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dubecco 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Pince | F.S.T.91150-20 | 2 pièces nécessaires | |
| Ciseaux fins | F.S.T. | 14090-09 | |
| Support de montage à fluorescence | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Contrecoloration des noyaux cellulaires |
| ImageJ | FIJI | Logiciel | |
| d’analyse et de traitement LAS X | Leica ; | Logiciel d’imagerie pour Leica DM6 B | |
| Lames de microtome S35 | Feather | 207500000 | |
| Micro-ondes | |||
| Sérum de chèvre normal | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. composé | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldéhyde 16 % | Pierce | 28908 | pipettes Pasteur sans méthanol |
| VWR | 612-1681 | ||
| Boîte de Pétri | TPP | 93100 | 100 mm de diamètre |
| Bascule 3D numérique | IKA Schü ; ttler | 00040010000 | |
| Bocaux de coloration pour lames | EasyDip | M900-12 | |
| Moules à échantillons | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Système de coloration StainTray M920 | StainTray | 631-1923 | Système de coloration pour 20 lames |
| Aiguille stérilisante | Braun | 4657705 | G 27 - utilisé pour l’injection (step 2) et l’épinglage (step 3 et 4) dans le protocole |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Bloqueur de liquide | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Seringues | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Base Tris | Roche | TRIS-RO | Composant pour 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Références
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Hea....
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Réimpressions et autorisations
