Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.
Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.
Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.
Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией1. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до конца не изучена2.
Уже в конце 1990-х годов исследования продемонстрировали большое влияние легочных вен (ЛП) на инициацию и поддержание мерцательной аритмии, поскольку они являются основным источником эктопическихсокращений, вызывающих мерцательную аритмию. Показано, что ВВ структурно отличаются от других кровеносных сосудов. В то время как типичные кровеносные сосуды содержат гладкомышечные клетки, оболочка ВП также содержит кардиомиоциты4. У грызунов эта сердечная мускулатура повсеместно присутствует на протяжении всего ВП, включая внутри- и внелегочные отделы, а также область отверстия5. У человека ВП также содержат кардиомиоциты, которые можно наблюдать в расширениях миокарда левого предсердия (ЛП) — так называемых рукавах миокарда (МС)6,7.
Рассеянный склероз имеет морфологическое сходство с миокардом предсердий8. Форма и размер предсердий и кардиомиоцитов ВП существенно не различаются между собой и демонстрируют сопоставимые электрофизиологические свойства8. Электрофизиологические записи в ПВ доказали электрическую активность рассеянного склероза, а ангиографическая визуализация выявила сокращения, синхронизированные с сердцебиением 9,10.
Щелевые контакты представляют собой порообразующие белковые комплексы, состоящие из шести субъединиц коннексина, которые обеспечивают прохождение ионов и малых молекул11. Щелевые контакты существуют в межклеточных аппозициях, соединяют между собой соседние кардиомиоциты и обеспечивают межклеточное электрическое соединение между кардиомиоцитами12,13. В сердце экспрессируется несколько изоформ коннексина, причем коннексин 43 (Cx43) является наиболее распространенной изоформой, экспрессируемой во всех областях сердца14. Предыдущие исследования свидетельствуют об экспрессии Cx43 в кардиомиоцитах PV15,16.
По-прежнему сложно исследовать рассеянный склероз в интактных ФВ из-за их тонкой структуры, особенно на моделях мелких животных. В этой статье мы продемонстрируем, как идентифицировать и изолировать ВП вместе с ЛП и долями легких у мышей с помощью микродиссекции под контролем микроскопии. Кроме того, мы демонстрируем иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание ФВ для визуализации кардиомиоцитов и их взаимосвязей внутри ФВ.
С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей л?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), Китайским стипендиальным советом (CSC201808130158 R.X.), Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученого-клинициста в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.) и Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. C.).
Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
Agarose | Biozym LE | 840104 | |
Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
DFC365FX camera | Leica | ||
DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
Dry ice | |||
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
Microwave | |||
Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |